一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法及其产品技术

本发明专利技术提出了一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法，通过采用独特的工艺条件，无需进行突变等处理，来达到单修饰的效果，工艺简单，成本低，且得到的聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子活性损失小，纯度高等，本发明专利技术还涉及由该方法制得的产品。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提出了一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法，通过采用独特的工艺条件，无需进行突变等处理，来达到单修饰的效果，工艺简单，成本低，且得到的聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子活性损失小，纯度高等，本专利技术还涉及由该方法制得的产品。【专利说明】一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法 及其产品
本专利技术涉及蛋白质的聚乙二醇修饰领域，特别是指一种聚乙二醇单修饰的人粒细 胞集落刺激因子的制备方法，本专利技术还涉及由该方法制得的聚乙二醇修饰的人粒细胞集落 刺激因子。
技术介绍
粒细胞集落刺激因子（G-CSF)是刺激骨髓细胞集落形成的集落刺激因子之一，能 够特异性的刺激和调节粒细胞系统的增殖、分化、存活和活化，主要用于各种原因引起的 中性粒细胞减少症，天然人粒细胞集落刺激因子（hG-CSF)含有174个氨基酸，分子量约为 19KDa，其中含有5个半胱氨酸（Cys)，Cys36与Cys42, Cys74与Cys64之间形成两对二硫 键，Cysl7为不配对半胱氨酸，而重组表达的人粒细胞集落刺激因子由于增加了一个起始密 码子，因此为175个氨基酸，相应的，未配对的半胱氨酸成为Cysl8。由于G-CSF在代谢过程 中易由肾小球滤过，在通过肾小管时又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出，临床表现 为半衰期短，易被酶水解和肾脏清除，因此，临床应用时需要对患者进行多次注射以维持一 定的疗效，这样会给患者带来很大的不便于痛苦，而且重复注射也会引起一些不良反应。 蛋白质或者多肽的聚乙二醇（PEG)修饰即PEG化，是将活化的PEG通过化学方法 以共价键偶联到蛋白质或多肽分子上，自1977年Davis首次采用PEG修饰BSA (牛血清白 蛋白）以来，PEG修饰技术迅速发展，并广泛应用于多种蛋白质和多肽的化学修饰。PEG修 饰能赋予蛋白质和多肽多种优良性能，具体表现为循环半衰期延长、免疫原性降低或消失、 毒副作用减少以及物理、化学、生物稳定性增强等，在很大程度上扩宽了蛋白质和多肽的应 用范围，其机理可能为：蛋白质PEG修饰后，相对分子质量（Mr )增大，当修饰后的蛋白质Mr 达到或超出肾小球滤过阀值时，蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球的滤过 作用；由于PEG的屏蔽效应，使得修饰后的蛋白质或多肽不易受到各种蛋白酶的攻击，降解 速率明显降低，稳定性提高；PEG在溶液中呈无规则卷曲，作为一种屏障，能掩盖蛋白质表 面的抗原决定簇，使蛋白质不能与各种细胞表面受体结合，不被机体的免疫系统识别，降低 了蛋白质的免疫原性；PEG与蛋白质偶联后能将其优良的理化性质赋予蛋白质，如能改善 蛋白质的生物分布和溶解性能。 但是传统的PEG修饰多为随机修饰，存在修饰剂呈现多种聚合度、选择性不够高、 修饰后蛋白质分子Mr分布宽、活性降低、稳定性有时不够理想等问题，对于hG-CSF的修饰， 不同的PEG修饰剂能够与hG-CSF上N-端的氨基、赖氨酸上的氨基，半胱氨酸上的巯基进 行反应，因此得到的为多种修饰产物的混合物，且每种产物的产量多少、活性高低均不同， 这对于应用带来很多不便，因此，我们需要对传统的修饰进行处理，已达到定点单修饰的效 果，传统的定点单修饰的方法主要从三个方面入手：蛋白质方面，如蛋白质的定点突变、蛋 白质可逆性位点定向保护、非天然氨基酸的引入等；PEG的活化形式，如修饰氨基的PEG-醛 和修饰巯基的PEG-乙烯基砜等；反应条件的控制，如PH值、金属离子或酶的催化等。专利技术 专利（专利申请号为00130974. 9)公开了 N-端化学修饰的蛋白质组合物及方法，所采用的 PEG-醛定点修饰蛋白质N端，但得到的产物仍然含多修饰产物的混合物。中国专利技术专利(专 利申请号为200810062516. 3)公开了一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突 变体的制备方法，所采用的就是将重组人粒细胞集落刺激因子的第18位半胱氨酸突变为 丝氨酸，从而将突变后的重组人粒细胞集落刺激因子突变体与带有氨基反应基团的PEG反 应，再分离纯化，得到聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体，由于此方法需要 对蛋白质进行突变，而突变之后对蛋白质的影响未知，所以，采用这种方法，一方面操作复 杂，另一方面，容易对蛋白质的性质、活性等产生影响，因此，适用范围有限。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种具有高生物活性的聚乙二醇单修饰的人粒细胞集 落刺激因子。 本专利技术的另一个目的是提供一种制备高生物活性的聚乙二醇单修饰的人粒细胞 集落刺激因子的方法。 本专利技术的另一个目的是提供一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的纯 化方法。 本专利技术的技术方案是这样实现的： -种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法，包括以下步骤： ①在hG-CSF溶液中加入0· 5-10m〇l/L的变性剂，在变性剂的存在下，hG-CSF中的 巯基便暴露出来，易于与所述特异性巯基修饰剂发生反应； ②加入特异性巯基修饰剂，所述特异性巯基修饰剂为PEG-马来酰亚胺、 PEG-邻-吡啶-二硫醚、PEG-乙烯基砜和PEG-碘乙酰胺中的一种，用量为hG-CSF摩尔量 的1-50倍，所述特异性巯基修饰剂能够特异的同hG-CSF种未配对的Cys上的巯基进行结 合； ③在无氧条件下，25-40°C反应1-24小时后，去除所述变性剂，从而使hG-CSF复 性； ④将步骤③中的反应物上样，经离子交换层析及凝胶过滤层析得到单修饰的 PEG-hG-CSF 纯品。 优选的： 步骤①中，在hG-CSF中加入浓度为4mol/L的盐酸胍或者尿素作为变性剂； 步骤②中，加入hG-CSF摩尔量10倍的PEG-邻-吡啶-二硫醚作为所述特异性巯 基修饰剂； 步骤③中，为在无氧条件下，室温反应4小时后，通过超滤将反应液置换至 10-100mmol/L、PH4. 0-5. 0 的醋酸缓冲液中； 步骤④中，将步骤③中的反应物上样，经10-100mmol/L、pH4. 0-5. 0的醋酸缓冲 液平衡过的阳离子交换柱，上样后，用0-100%的含lmol/L氯化钠、浓度为10-100mm〇l/L、 PH4. 0-5. 0的醋酸缓冲液线性洗脱，收集主峰为PEG-hG-CSF，经过凝胶过滤柱柱脱盐，并更 换缓冲液为l〇-l〇〇mM醋酸缓冲液PH4. 0-5. 0,即得到单修饰PEG-hG-CSF。 根据上述方法制得的一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子，由人粒细胞 集落刺激因子Cysl7上的巯基结合聚乙二醇构成。 优选的，所述特异性巯基修饰剂为PEG-马来酰亚胺、PEG-邻-吡啶-二硫醚、 PEG-乙烯基砜和PEG-碘乙酰胺中的任一种。 优选的，所述特异性巯基修饰剂的Mr为lKDa至60KDa，性状为直链状或分支状。 更优选的，所述特异性巯基修饰剂是Mr为lOKDa的PEG-邻-吡啶-二硫醚。 对于重组的人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF)，由于其于天然人粒细胞集落刺激 因子（hG-CSF)的区别仅在于多了一个自由氨基酸，未配对的半胱氨酸由第17位排到第18 位，因此，其也可以采用本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种聚乙二醇单修饰的人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①在hG‑CSF溶液中加入0.5‑10mol/L的变性剂；②加入特异性巯基修饰剂，用量为hG‑CSF摩尔量的1‑50倍；③在无氧条件下，25‑40℃反应1‑24小时后，去除所述变性剂；④将步骤③中的反应物上样，经离子交换层析得到单修饰的PEG‑hG‑CSF纯品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王军，张静，张楠，慕彩梅，
申请(专利权)人：深圳新鹏生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44