一种基于双酶偶联高通量检测微生物生产异戊醇的新方法技术

技术编号:10540361 阅读:244 留言:0更新日期:2014-10-15 16:20
本发明专利技术涉及一种基于双酶偶联反应的高通量检测微生物生产异戊醇的新方法,其中,异戊醇氧化酶为重组毕赤酵母表达所得。具体涉及利用异戊醇氧化酶和过氧化物酶偶联,在相应缓冲溶液中与异戊醇的反应,产生显色物质醌亚胺。双酶偶联反应在96微孔板中进行,利用酶标仪读取500nm吸光值。异戊醇与双酶偶联反应生成产物在500nm处的吸光值与异戊醇浓度成线性关系,能够根据标准曲线计算浓度,并利用酶标仪和96微孔板进行高通量检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种基于双酶偶联反应的高通量检测微生物生产异戊醇的新方法,其中,异戊醇氧化酶为重组毕赤酵母表达所得。具体涉及利用异戊醇氧化酶和过氧化物酶偶联,在相应缓冲溶液中与异戊醇的反应,产生显色物质醌亚胺。双酶偶联反应在96微孔板中进行,利用酶标仪读取500nm吸光值。异戊醇与双酶偶联反应生成产物在500nm处的吸光值与异戊醇浓度成线性关系,能够根据标准曲线计算浓度,并利用酶标仪和96微孔板进行高通量检测。【专利说明】
本专利技术属于工业微生物筛选和开发利用领域,特别涉及一种基于双酶偶联反应的 高通量检测微生物生产异戊醇的检测方法。 技术背景 由于化石燃料的日益枯竭以及其对环境产生的破坏性影响,可持续利用资源的探 索受到越来越多的关注。近年来,生物能源因其可再生性和对环境产生的负担较小而得到 越来越多的青睐。微生物的多样性、生物技术的快速发展、研究方法的不断创新以及仪器的 更新换代大大推进了生物能源的研发和利用。以生物乙醇为例,2008年美国生产生物乙醇 量已达92亿加仑(约合350亿升)。但是由于乙醇饱和蒸汽压较高、吸水性强、具有腐蚀 性等特性,现有的运输设备不能较好完成乙醇的运输。与乙醇相比,分支长链醇(简称支链 醇),如异戊醇(3-甲基-1-丁醇),能量密度是汽油能量密度(34.8MJ/liter)的81%,而 乙醇仅占汽油能量密度的70%,其饱和蒸汽压比乙醇低20多倍。此外,异戊醇具有较小的 腐蚀性,可以利用现有的运输系统进行传送。异戊醇具有的能量密度较高,饱和蒸汽压较低 且腐蚀性低等多方面的优点使其成为除乙醇外可以代替汽油的新型生物能源。除了可用作 新型的生物燃料,异戊醇(3-甲基-1-丁醇)还用于照相化学药品、香精、分析试剂,以及用 于有机合成、制药等方面,是一种重要的化工材料。 自然界中产异戊醇的主要是一些真菌类和酵母类微生物。通过生物工程等技术手 段对大肠杆菌进行代谢途径的改造,其异戊醇产量可达l〇g/L。在微生物代谢过程中,异戊 醇作为产物被释放到培养基中,为了检测生产菌种产异戊醇的能力,需要测定培养基中异 戊醇的含量。目前异戊醇测定方法主要有气相色谱法和液相色谱法。色谱法能检测微量异 戊醇,精密度和准确性很高,但仪器昂贵、操作和维护繁琐,如果检测样品较多,也会存在 保留时间的偏移等问题,难以完成通量筛选产异戊醇菌株的要求。而从自然界筛选并在实 验室诱变进化一直是发现和创新微生物菌种的重要途径,是工业生物技术产业的基础。包 括代谢工程在内的生物学手段极大地丰富了工程菌株的资源,但相应的筛选方法依然是个 瓶颈。因此寻求一种简便、快速、准确的方法检测异戊醇,对于高通量筛选高产异戊醇菌株 具有重要意义。
技术实现思路
【本专利技术的目的】 本专利技术的目的在于提供一种基于双酶偶联反应的高通量检测微生物生产异戊醇 的新方法。利用克隆表达所得的异戊醇氧化酶和过氧化物酶偶联的方法测定异戊醇产量, 高通量筛选目标微生物。与传统异戊醇检测方法相比,基于双酶偶联反应的高通量筛选方 法具有成本低、效率高、操作简便、目的性强的优点,能够从较大的菌株库中筛选性能优良 的菌株。 【本专利技术的思路】 利用异戊醇氧化酶和过氧化物酶偶联的方法,测定异戊醇含量。异戊醇氧化酶由 重组毕赤酵母诱导表达所得。该方法包含两个关联反应,首先,在氧气存在条件下,异戊醇 被其氧化酶氧化,生成异戊醛和过氧化氢,然后过氧化氢与4-安替比林和苯酚在过氧化氢 酶作用下形成醌亚胺,生成的醌亚胺是一种红色物质,在500nm处有特征吸收值。该关联反 应中异戊醇、过氧化氢和醌亚胺存在比列关系,因此可以通过500nm吸收光的测定,推算出 异戊醇的含量。利用本专利技术,微生物代谢产生的异戊醇通过96微孔板和酶标仪,通过双酶 偶联方法分析检测代谢产物,筛选高产异戊醇的菌株,提供宝贵的菌种资源。 【本专利技术的技术路线】 本专利技术的技术路线如下: (1)将含有异戊醇氧化酶基因的重组毕赤酵母X-33诱导表达,取诱导48h的表达 产物并超滤浓缩,作为异戊醇氧化酶粗酶液待用。若分批次表达,则保证异戊醇氧化酶粗 酶液的蛋白浓度一致。 (2)将待分析的于标准96微孔板内冻存保藏的突变库复制到对应的标准96微孔 板中,活化培养12h。 (3)将上述菌液对应转至含有发酵培养基的96深孔板中,用硅胶盖盖好,发酵培 养 12h。 (4)将96深孔培养板利用冷冻离心机进行离心,使菌体沉淀。 (5)取96深孔培养板中的上清液与异戊醇氧化酶和过氧化物酶和其他反应试剂 在96微孔板中反应,30°C保温2h。 (6)将反应结束的96微孔板利用酶标仪测定在500nm处的吸光值,并将测定的吸 光值与利用异戊醇氧化酶和过氧化氢酶测定的异戊醇标准曲线进行对比,计算出异戊醇的 浓度。 (7)将测定产异戊醇浓度高的生产菌株进行保存。 【本专利技术的优点】 本专利技术的优点是: (1)效率高,异戊醇氧化酶和过氧化物酶偶联能够快速检测异戊醇的含量。 (2)通量高,96深孔培养板和96微孔板并结合酶标仪一起使用,使得目的菌株的 筛选速度大大提高。 (3)成本低,能够以较低成本获得大量菌种。 (4)较为精确,能反应出同类菌种产异戊醇水平的高低。 (5)可以获得更多菌株,为基础研究提供菌种资源。 具体实施 以下为列举的实施例,以便于更好地理解本专利技术。 实施例1、 异戊醇氧化酶的克隆与表达。利用异戊醇氧化酶和过氧化物酶偶联的方法测定异 戊醇含量,首先需要制备异戊醇氧化酶。 (1)异戊醇氧化酶基因(mreA)来源于米曲霉(Aspergillus oryzae),其CICC(中 国工业微生物菌种保藏中心)编号为40465。利用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)提取米 曲霉 total RNA,并利用 RevertAid? Premium First Strand cDNA Synthesis Kit#K1651, #K1652(Fermentas)反转录出 cDNA。 (2)表达载体pFLD a -mreA的构建。以米曲霉cDNA为模板克隆出异戊醇氧化酶基 因(mreA)(附图 1)。5,端引物 Primerl :5,-cggGGTACCatggctgacagctcatcttg-3'(大写 字母表不邱111酶切位点);3'端引物?1';[111612:5'-(31:0666(11^30308803。31:1:(31:1:-3'(大 写字母表示Apal酶切位点)。该引物设计去除了 mreA基因5'端的信号肽序列72bp,并引 入起始密码子ATG。克隆产物及载体pFLDa分别双酶切(Kpn I-HF及Apa I-HF)处理后连 接为重组载体pFLD a -mreA。 (3)重组载体转化至E. coli。重组载体pFLD a -mreA热激法转化至E. coli DH5 α, 挑选具有氨苄青霉素抗性的阳性克隆。 (4)毕赤酵母感受态制备及重组载体转化至毕赤酵母。从上述DH5ci提取足量质 粒pFLDa- mreA,用Nde I内切酶线使其性化。线性化片段用本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种利用异戊醇氧化酶和过氧化物酶偶联反应的检测微生物生产异戊醇的高通量检测新方法,步骤如下: (1)将含有异戊醇氧化酶基因的重组毕赤酵母X‑33诱导表达,表达产物超滤浓缩,作为异戊醇氧化酶粗酶液,待用。 (2)将待分析的冻存保藏突变库接种至标准96微孔板中,过夜培养后转接至96深孔板中培养; (3)将96深孔培养板利用冷冻离心机在合适的条件下离心,取其上清液进行测定; (4)利用双酶偶联的方法,在96微孔板中结合BufferI和BufferII测定上述上清液中异戊醇含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:王钦宏孙琳涂然
申请(专利权)人:中国科学院天津工业生物技术研究所
类型:发明
国别省市:天津;12

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