B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用制造技术

本发明专利技术公开了B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用。以纯化好的B19病毒VP1独特区蛋白经尾静脉注射BALB/c小鼠。共注射3次，每次间隔10d，最后1次注射后10d，取标本进行相关检测。经肾脏组织分别行光镜、电镜和TUNEL免疫荧光分析，尿液行尿常规检查。结果表明B19病毒VP1独特区蛋白引起肾脏组织及尿液改变，说明了其能够成功的构建病毒性肾病动物模型。常见的活病毒感染建立病毒性肾病动物模型有一定的危险性，而本发明专利技术采用B19病毒VP1独特区蛋白建立病毒性肾病动物模型具有安全性好、可操作性好及成功率高的特点。

【技术实现步骤摘要】
B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用
本专利技术属于病毒性肾病模型构建
，涉及B19病毒VP1独特区蛋白构建病 毒性肾病模型的应用。
技术介绍
1、病毒性肾病的研究现状 病毒性肾病是一组因病毒感染而导致的肾脏疾病，常见的病原有乙型肝炎病毒（HBV)、 丙型肝炎病毒（HCV)、B19病毒、艾滋病病毒（HIV)等。国外报道B19病毒感染引起的病毒性 肾病包括肾小球肾炎、肾病综合征、肾功能不全等疾病。近来，B19病毒感染被认为与临床 表现重、治疗效果差、病程进展快、预后差的塌陷性肾小球病（CG)密切相关，CG患者肾脏组 织和外周血中B19病毒DNA检出率分别为78%和87%。国内郝文等报道B19病毒感染是过 敏性紫癜发病的重要原因之一，且B19病毒感染更易引起肾脏病变。余建莉等发现肾脏病 患儿B19病毒感染阳性率明显高于健康儿童，原发性肾脏病中急性肾小球肾炎B19病毒感 染阳性率最高，继发性肾脏病中狼疮性肾炎B19病毒感染阳性率最高。王薇等发现B19病 毒感染引起的肾脏疾病有自限性，其中女性患者较多。 目前研究认为病毒感染致肾脏病变的机制包括：①病毒蛋白或组织中的致炎因子 引起肾脏细胞坏死、凋亡或功能障碍；②病毒抗原与肾小球直接结合，针对病毒抗原的免疫 反应引起肾脏损伤；③循环系统中的抗原抗体免疫复合物损伤肾脏；④病毒对肾小球的直 接破坏；⑤肾小管间质因细胞病变和肾小球产生的炎症因子而损伤；⑥血流动力学紊乱； ⑦抗病毒治疗引起肾脏损伤。病毒感染导致肾脏病变涉及的信号通路主要有TNFR信号通 路、Notch信号通路、⑶NF / Ret信号通路。Komatsuda A等认为B19病毒抗原刺激产生的 抗体所形成的抗原抗体复合物是B19病毒感染引起肾脏损伤的原因之一。 2、B19病毒及其致病性 人细小病毒 B19 (Human Parvovirus B19, PVB19)是 1975 年 Cossart YE 用对流免疫 电泳法筛选健康献血者血液中乙型肝炎病毒时于第19号标本中偶然发现的，因此得名。它 是细小病毒科细小病毒属中目前己知的唯一致人类疾病的病毒，也是动物病毒中体积最小 结构最简单的DNA病毒。1981年，在患镰状细胞贫血和再生障碍性贫血的儿童中检测到这 种病毒，从而证实了其致病性，以后又相继在传染性红斑（又称第五病）、血小板减少性紫 癜、关节病、心肌炎、心包炎、急性肝炎患者中检测到该病毒，而且还发现该病毒能通过胎盘 感染胎儿，引起孕妇流产、早产或胎儿水肿、死胎。1987年在1例先天性免疫缺陷综合征贫 血病人中证实存在有慢性B19病毒感染。随后的研究显示在AIDS患者、器官移植的受者、 化疗的肿瘤病人等免疫抑制患者中都有慢性持续性B19病毒感染的存在。近年来，还证实 B19病毒感染与川崎病、一过性成红细胞减少、系统性红斑狼疮、皮肌炎、慢性自身免疫性血 小板/中性粒细胞减少症、某些严重的肝炎、由免疫复合物介导的肾脏损害及睾丸生殖细 胞瘤等疾病有关，甚至可引起败血症。 B19病毒颗粒由两个衣壳蛋白和一条线状的单链DNA分子组成，呈对称的二十面 立体结构，无包膜，直径22-24nm，平均23nm。在电镜和阴性染色中可见空壳和完整的病毒 颗粒，成熟的有感染力的病毒颗粒分子量为5. 6X106道尔顿，其中DNA占全重的一半。B19 病毒基因为单链小DNA，全长5596bp，两端有383bp长的重复序列形成复式发卡结构，G、C 含量高，具有强同源性，是合成整条链的引物。两端的复式发卡结构使得B19病毒基因二级 结构牢固，而不易克隆入细菌中。在B19病毒基因组内有两个大的开放读框，几乎延伸整个 基因组，左侧的开放读框（406-2501bp)编码非结构蛋白（NS)，右侧的开放读框编码两个衣 壳蛋白VP1和VP2。VP2的氨基酸编码序列（3088-5093bp)包含在VP1的氨基酸编码序列 (2416-5093bp)中，其组成比后者少226个氨基酸的氨基尾，故这两种衣壳蛋白在氨基酸组 成上具有同一'I生。 B19病毒的细胞受体主要是红细胞糖苷脂，也被称为P抗原，它是一种中性糖脂。 P抗原主要是在红系祖细胞、成熟红细胞、巨核细胞、内皮细胞和平滑肌细胞上，这与B19病 毒感染引起的疾病相关。P抗原或抗P抗原抗体可以保护细胞不被B19病毒感染，P抗原阴 性血型的人不感染B19病毒。然而，也有体外试验发现B19病毒不与P抗原结合。α5β1 整合素复合物（ α5β 1 integrin complex)是Β19病毒进入细胞的核心受体。Ku80 DNA结 合蛋白也被认为与B19病毒进入细胞有关。有一个有趣的现象,只有极少数的B19病毒与 细胞膜上P抗原结合后进入细胞内，大多数的B19病毒从结合的细胞膜上脱落下来，将这些 脱落的B19病毒加入没有被感染过的细胞中时，这些脱落的B19病毒有极强的结合能力和 传染性，深入研究发现这与B19病毒结合P抗原后病毒蛋白构象发生变化，结合位点被暴露 出来有关。B19病毒通过内吞作用进入细胞质，网格蛋白、发动蛋白和细胞骨架都参与了这 一过程，内吞膜泡被运送到细胞核的周边。Ras超家族成员Rapl通过调节β 1整合素复合 物受体和或微管网络控制内吞膜泡在细胞质中运输。VP1独特区区域随着内吞膜泡内pH值 降低而完全暴露在病毒衣壳表面，暴露区域中包含PLA2结构域，PLA2结构域劈开膜泡，VP2 区域的NLS介导病毒衣壳与转入蛋白结合，发生构象变化的病毒核酸通过核膜孔复合物进 入细胞核。VP1独特区蛋白对于B19病毒进入宿主细胞至关重要，如果VP1独特区蛋白因核 酸突变导致构象变化，病毒核酸将无法进入细胞核。 1983年，Mortimer PP等首次提出B19病毒对红系祖细胞有细胞毒性。Srivastava A等发现B19病毒与红系祖细胞和巨核细胞的P抗原结合后，由NS1蛋白引起细胞死亡。 Moffatt S等提出NS1蛋白引起细胞死亡是通过激活caspase 3,触发细胞凋亡所导致的。 B19病毒诱导细胞凋亡的特性并在超微结构下得以证实。深入研究发现NS1蛋白中的三磷 酸核苷结合结构域与B19病毒诱导细胞凋亡有关，这一过程包括：NS1蛋白阻止细胞膜两边 Na+与H+交换，降低胞内pH值；触发了 TNF受体信号通路，激活caspase3和caspase6 ;激 活p53,诱导Bax表达，再激活caspase 9。此后，Chen AY等认为llkDa蛋白诱导细胞凋亡 的能力比NS1蛋白强，如果抑制llkDa蛋白合成，B19病毒感染导致细胞凋亡的能力明显减 弱，并且还发现细胞浆中的llkDa蛋白浓度是细胞核中NS1蛋白浓度的100倍，llkDa蛋白 诱导细胞凋亡与激活caspase 10有关。 B19病毒感染急性期是多种自身抗体产生的重要时期，这些自身抗体包括aCL、 ai3 2GP I、dsDNA、抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA)，抗蛋白水解酶3抗体（aPR3-ANCA)和抗 髓过氧化物酶抗体（aMPO-ANCA)也短暂出现。自身抗体在分子拟态机制下具有病毒抗原表 位，引起免疫紊乱，抗独特型抗体也参与了自身抗体的产生和本文档来自技高网...

【技术保护点】
B19病毒VP1独特区蛋白在制备构建病毒性肾病模型的试剂中的应用。

【技术特征摘要】
1. B19病毒VP1独特区蛋白在制备构建病毒性肾病模型的试剂中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，B19病毒VP1独特区蛋白被制成注射剂。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的注射剂中B19病毒VP1独特区蛋白的 浓度不小于1. Omg/mL。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的注射剂中B19病毒VP1独特区蛋白的 浓度为1. 2mg/mL。5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂晓晶，马雷，丁晓华，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区福州总医院，
类型：发明
国别省市：福建;35