选择性量化A-β聚集体的方法技术

本发明专利技术涉及选择性量化A-β聚集体的方法，包括将抗A-β抗体固定在基材上，将样品施加于基材上，加入用于检测的标记的探针，其通过特异性结合A-β聚集体标记这些探针和检测标记的聚集体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及选择性量化Α-β聚集体的方法，包括将Α-β捕获分子固定在基材上，将待研究的样品施加于基材上，加入用于检测的标记的探针，其通过特异性结合Α-β聚集体标记这些探针,并检测经标记的聚集体。A-β聚集体出现于阿尔茨海默病(AD，阿耳茨海默氏痴呆，拉丁语=MorbusAlzheimer)。其包括帕金森氏病例如属于一种由不同种类组成的临床病症,其共同标准在许多情况(但不排除其它情况)下是各个特定蛋白质以β折叠结构的有序构象的细胞外全身性或局部沉积。由年龄决定的痴呆是当今社会中一个越来越大的问题，这是因为由于提高的预期寿命，越来越多的人遭受其苦并因此对社会保险系统和其可资助性产生影响。内源蛋白质病理学聚集体，例如寡聚物或纤丝，出现于许多神经变性疾病中。在阿尔茨海默痴呆的情况下，例如在大脑中发现β淀粉样肽沉积物(Α-β肽沉积物)和在帕金森氏病情况下，共核蛋白(Synuclein)沉积物。然而，β淀粉样肽沉积物(或肽_纤丝)仅是过程的最后阶段，其以从来自APP(淀粉样前体蛋白)的单体β淀粉样肽的分裂开始，然后形成神经毒性的β淀粉样肽寡聚物并最后以斑点中的β淀粉样肽纤丝的沉积物结束。AD的主要病理学特征是由A-β肽组成的老年斑或淀粉样斑的形成。此外，产生来自Tau蛋白的神经纤丝沉积物。A-β肽的前体蛋白质，ΑΡΡ，定位于神经元的细胞膜中。通过蛋白质水解降解和之后的修饰，由此产生不同长度和类型的A-β片段，例如A-β 1-40,A-β 1-42、或pGluA- β 3-42。单体A- β肽也在健康机体的整个一生期间都产生。按照自1990年代的淀粉样蛋白级联假说，以斑点形式的Α-β沉积物是疾病症状的触发者。然而近年来，不同的研究表明，特别是小的、自由扩散的Α-β寡聚物在所有Α-β类别中具有最大的毒性，并且对AD的发生和进展负责。因此，Α-β肽的聚集体与AD发病机理直接相关。然而目前，可靠的诊断在引人关注的临床症状出现以后才是可能的，在这种情况下，以最大90%的可靠性为出发点。目前存在的至今唯一可靠的诊断可能，直到患者死亡后通过大脑中各种不同改变的组织学检测。因此，需要鉴定和量化估计A-β聚集体，尤其是小的、自由扩散的A-β寡聚物或聚集体的方法。迄今为止仅仅描述了几种表征和量化组织和体液中致病性聚集体或寡聚物的方法。与A-β结合并抑制其聚集的化合物例如由Chafekar等(ChemB1Chem 2007,8,1857-1864)获知。这些物质由A-β肽(KLVFF序列)中的部分组成并用于治疗目的，没有用这些物质进行组织和体液中的致病性聚集体或寡聚物的表征和量化。目前，对于AD，还没有公认的标准和/或鉴定，所谓的生物标志物。至今这种生物标志物的出发点是使用PET放射性示踪剂用于成像方法，这基于放射活性标记的物质结合淀粉质斑块的假设并因此在检测之后可以是斑块沉积的测量。尽管在PET信号和疾病之间有显而易见的联系，但至今仍不能由此使可靠的诊断成为可能，因为许多没有老年痴呆的人也表现出高示踪剂保留。高成本和在仪器上必要的技术开支对这些方法也是不利的，其中仪器并不是随处可获得的。作为其它的出发点，目前正在研究患者的血液或脊髓液(CSF)中多种物质的量和分析它们作为生物标志物有用性。这些物质之一为A-β肽。迄今为止，患者脊髓液中单体A-β含量的测定，可能地与Tau浓度的测定相结合似乎最可靠。然而，该值有如此高的变化以致不能利用这种生物标志物对个体进行可靠的诊断。这种方法的应用由DE69533623 Τ2获知。尽管有这些不同的方法，但迄今为止任何可靠的生物标志物得到公认还是不可能的。其它困难是对于A-β聚集体的具体量化与A-β单体和/或A-β总含量相反,迄今为止只有几种检测系统可获得。作为可能的检测系统，目前采用ELISAs，其中Α-β寡聚物利用抗体检测。其中所用的抗体识别仅非常特异性的类型的Α-β寡聚物或不是由Α-β肽构成的非特异性的其它寡聚物，但在非常不同的蛋白质中，其对评价有不利的影响。利用构象异构体-特异性抗体应用ELISA支持的方法例如由W02005/018424 Α2获知。作为其它检测方法，采用夹心ELISA测量法。本专利技术中为了固定Α-β分子使用Α-β-特异性抗体。相同的抗体随后也用于检测。通过此方法，单体不产生信号，因为抗体结合位点已经被捕获分子占据。特定的信号因此只由二聚体或较大的寡聚物产生。然而在该评价中，这样一种方法仅能够量化存在于样品中的所有聚集体的总和而不能表征个别的聚集体。为了可靠地检测和量化个别的Α-β聚集体，ELISA支持的方法也缺少对此必需的敏感性。此种夹心ELISA法的应用由W02008/070229 Α2获知。本专利技术的目的要提供一种蛋白质聚集疾病、尤其是AD的生物标志物，和一种量化和表征Α-β聚集体的超灵敏的方法。通过表征生物标志物，即测定体液或组织中该物质(生物标志物)的数目、量和/或尺寸，疾病和/或有关疾病的病程和患者的状况的信息的确切诊断将成为可能。本专利技术的其它目的要提供选择性量化导致和/或表征蛋白质聚集疾病的致病性聚集体的方法，尤其是任何尺寸和组成的A-β聚集体、Α-β寡聚物以及同时还有小的、自由扩散的A-β寡聚物。此目的通过选择性量化和/或表征A-β聚集体的方法来实现，包括下列步骤:a)将待测样品施加于基材上，b)加入用于检测的经标记的探针，其通过特异性结合A-β聚集体标记这些Α_β聚集体，和c)检测标记的聚集体，其中步骤b)可在步骤a)之前实施。A-β聚集体或A-β寡聚物的表征指形式、尺寸和/或组成的测定。本专利技术意义上的术语A-β单体描述一种肽分子，其为淀粉样前体蛋白APP的一部分，其以名称Α-β已知。根据来源种类(人和/或动物)和加工，Α-β单体的精确氨基酸序列可在长度和特性上变化。本专利技术意义上的术语Α-β寡聚物既描述Α-β聚集体又描述Α-β寡聚物以及小的、自由扩散的Α-β寡聚物。本专利技术意义上的寡聚物为由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个单体或其多倍体形成的聚合物。在此可能的是，A-β寡聚物中A-β单体必须是彼此相同的，但不一定是所有。因此Α-β聚集体将理解为既指A-β寡聚物又指小的、自由扩散的A-β寡聚物。这还包括聚集体，例如描述了纤丝的片段，“初纤维”、“ADDLs”和p56'对本专利技术必要的是:关于尺寸Α-β聚集体为在体内可迁移的聚集体或聚合物而不是由于其固定在体内以淀粉样-β肽斑块沉积物的形式存在的尺寸。作为基材，根据本专利技术选择具有尽可能低的非特异性的结合能力的物质，特别是鉴于Α-β寡聚物。在本专利技术的一个实施方式中，选择玻璃基材。基材可用亲水材料涂覆，亲水材料优选聚-D-赖氨酸、聚乙二醇(PEG)或右旋糖酐。在本专利技术的一个实施方式中，将玻璃表面羟基化并随即用氨基基团活化。为了制备待涂覆的基材，实施下列步骤中的一个或多个步骤:在超声波浴或血浆清洁器中洗涤玻璃基材或玻璃载片，作为此步骤的替代，在5MNaOH中温育至少3小时，用水冲洗随后在氮气下干燥，浸溃在比例为3: I的浓硫酸和过氧化氢的溶液中以活化羟基基团，用水冲洗至中性pH，然后用乙醇冲洗并在氮气氛下干燥，浸溃在3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择性量化和/或表征A‑β聚集体的方法，包括下列步骤：a)将待测样品施加于基材上，b)加入用于检测的经标记的探针，其通过特异性结合A‑β聚集体标记这些A‑β聚集体和c)检测标记的A‑β聚集体，其中步骤a)可在步骤b)之前实施。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.23 DE 102011057021.71.一种选择性量化和/或表征A-β聚集体的方法，包括下列步骤: a)将待测样品施加于基材上， b)加入用于检测的经标记的探针，其通过特异性结合Α-β聚集体标记这些Α-β聚集体和 c)检测标记的A-β聚集体，其中 步骤a)可在步骤b)之前实施。2.根据权利要求1的方法，其特征在于，在步骤a)之前将捕获分子固定在基材上。3.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，进行样品的预处理。4.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，使用玻璃基材。5.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，基材具有亲水性涂层。6.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，基材用右旋糖酐涂覆。7.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，所述捕获分子与基材或与涂层共价结8.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，所述捕获分子用荧光染料标记。9.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，所述捕获分子为抗A-β抗体。10.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，所述抗A-β抗体特异性结合A-β聚集体的表位。11.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，使用A-β肽-特异性探针。12.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，所述探针为荧光染料-标记的抗A-β抗体。13.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，使用两种或两种以上不同的探针。14.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，使用两种或两种以上具有不同标记的荧光染料的探针。15.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，至少一种探针为特异性结合A-β肽的N端表位的抗A- β抗体。16.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，检测通过空间分辨荧光显微术进行。17.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，检测通过共聚焦荧光显微术、荧光相关光谱法(FCS)...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·威尔伯尔德，S·A·丰克，L·旺迪特里希，E·比克曼，O·班纳赫，
申请(专利权)人：于利希研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE