一种FRM1基因CGG序列重复的检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种FRM1基因CGG序列重复的检测方法及应用。其特征在于，其包括如下实现步骤：设计了两对引物，内参引物和检测引物，一对内参引物位于CGG重复区的5’端，另外一对检测引物跨越整个CGG重复区。当此检测引物覆盖区域内的CGG重复数在0至200之间，会扩增出一条（470+3n）bp（n为CGG重复数）的片段；当此检测引物覆盖区域内的CGG序列重复数超过200时，实验条件限制反应，扩增不出任何的片段的；此技术在同一个反应体系中同时扩增两条不同的产物，根据和DNA标记之间的比对来鉴定样本基因型。本发明专利技术的方法可用于检测FRM1基因CGG序列重复，可以辅助快速方便地查出脆性X染色体综合征致病基因的携带者以及病人，可应用于产前诊断、阻止患儿出生，降低脆性X综合症的发病率。

【技术实现步骤摘要】
-种FRM1基因CGG序列重复的检测方法及应用
本专利技术属生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，聚合酶链式反应。
技术介绍
FMR1基因位于X染色体的q27. 3,序列长度约38kb，由17个外显子和16个内含子 组成，编码脆性X智力残疾基因蛋白（FMRP)。FMR1基因是一个高度保守的基因，其5'端外 显子上的非翻译区内有一个（CGG) η三核苷酸串联重复序列，（CGG) η片段在重复模式上存 在多态性，并且可以遗传，在其上游大约250bp处有一个CpG岛。正常FMR1基因（CGG)n中 η的数值介于7至54之间。当η增加到54至200时，携带者表型虽正常，但在传代过程中易 发生进一步扩展，这种FMR1基因的突变称为FMR1基因的前突变。前突变的FMR1基因中的 CpG岛一般不甲基化，FMR1基因具有正常的转录和蛋白质水平，不表现出临床症状。当η扩 展达200以上时，男性表型100%表现为典型的脆性X染色体综合征（Fragile X Syndrome)， 女性中也有30%-50%表型表现轻重程度不等的智力残疾（Martin-Bell综合征)，这种FMR1 基因的突变称全突变。前突变至全突变的扩展是严格母系的遗传，全突变（CGG)n重复序列 大量扩展，引起FMR1基因5'端CGG序列重复区一侧的CpG岛异常甲基化，使FMR1基因失， 导致FMRP的缺失引起智力残疾。 FMR1基因突变可以导致脆性X染色体综合征，是智力残疾的主要因素之一。脆性X 染色体综合征是一种发病率仅次于先天愚型的遗传性智能低下综合征，发病率占全部儿童 的0. 05%，呈X连锁遗传，占 X连锁智能低下的40%。其外显率因性别不同有差异，男性80%， 女性30%。95%以上的脆性X染色体综合征患者发病的分子遗传学基础是FMR1基因（CGG) η结构扩展的动态突变引起的，约5%以下则是由于FMR1基因的错义突变和缺失型突变影响 了 FMRP的正常结构导致的。脆性X染色体综合征发病率高，临床表现复杂，遗传规律明确， 目前无有效的治疗方法，要降低其发病率，关键是查出携带者及病人，然后通过遗传咨询、 产前诊断、阻止患儿出生。 目前针对FMR1基因的检测方法主要为RFLP连锁分析、DNA杂交分析、PCR扩增等 方法，但是由于FMR1基因 CGG序列重复区和CpG岛中高含量的CG使FMR1基因的DNA解链 以及引物的延伸都变得非常困难。 鉴于以上的问题，一种可操作性更强的检测方法的专利技术是一种趋势的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题主要是： FMR1基因其5'端外显子上的非翻译区CGG序列重复区和CpG岛中有高含量的CG，这 使FMR1基因的DNA解链以及引物延伸变得非常困难，这使得针对FMR1基因的PCR扩增和 测序反应的一次成功率很低，失败率高。 已有的报道中所采用的检测方法是采用一种针对高GC含量的PCR扩增方法，但 是，针对CG含量如此高的序列在实际操作中并不容易实现，失败的几率非常高，不能开发 为针对FMR1基因中CGG序列重复数的稳定检测手段。 为了解决以上问题，本专利技术技术提供了一种检测FRM1基因 CGG序列重复的方法， 其包括如下实现步骤： 在FMR1基因 CGG序列重复区设定一对内参引物：正向引物F和反向引物M，扩增的片 段作大小约为220bp，用于验证PCR反应是可行的和为计算CGG序列重复数提供基准。 所述扩增的内参引物序列为： SEQ NO. 1 F :5' -CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3' SEQ NO. 2 Μ:5' -CGCTGCGGGTGTAAACACTGAAACCACGTC -3' 在FMR1基因 CGG序列重复区下游设定一对引物：正向引物F1和反向引物R，扩增片段 大小约为（470+3n) bp (η代表CGG重复数)，用于确定CGG序列重复数所在的区域。 所述扩增的反向引物序列为： SEQ NO. 3 F1 :5' -CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3' SEQ NO. 4 R:5' -AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA -3' 所述具体处理步骤如下： (1) DNA提取，取200 μ L DNA样本溶液用试剂盒提取DNA，采用核酸分析仪或分光光度 计进行DNA浓度及纯度鉴定； (2) 反应体系的配置,在每一个反应孔中加入一定的反应体系； (3) 按一定的程序进行扩增； (4) 电泳检测扩增结果。 所述反应体系以下：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种FRM1基因CGG序列重复的检测方法及应用，其特征在于，其包括如下实现步骤：设计了两对引物，内参引物以及检测引物，一对内参引物位于CGG重复区的5’端；另外一对检测引物跨越整个CGG重复区；所述扩增的内参引物序列为：SEQ NO.1 F：5’‑CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC ‑3’SEQ NO.2 M：5’‑CGCTGCGGGTGTAAACACTGAAACCACGTC ‑3’所述扩增的检测引物序列为：SEQ NO.3 F1：5’‑CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC ‑3’SEQ NO.4 R：5’‑AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA ‑3’。

【技术特征摘要】
1. 一种FRM1基因 CGG序列重复的检测方法及应用，其特征在于，其包括如下实现步 骤： 设计了两对引物，内参引物以及检测引物，一对内参引物位于CGG重复区的5'端；另外 一对检测引物跨越整个CGG重复区； 所述扩增的内参引物序列为： SEQ NO. 1 F :5' -CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3' SEQ NO. 2 Μ:5' -CGCTGCGGGTGTAAACACTGAAACCACGTC -3' 所述扩增的检测引物序列为： SEQ NO. 3 F1 :5' -CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3' SEQ NO. 4 R:5' -AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA -3'。2. 根据权利1所述的FRM1基因序列CGG重复的检测方法，检测的引物可以采用相同或 不同的荧光染料标记。3. 根据权利要求1所述的FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征在于：所述方 法的具体处理步骤如下： (1) DNA提取，取200 μ L DNA样本溶液用试剂盒提取DNA，采用核酸分析仪或分光光度 计进行DNA浓度及纯度鉴定； (2) 反应体系的配置,在每一个反应孔中加入一定的反应体系； (3) 按一定的程序进行扩增； (4) 电泳检测扩增结果。4. 根据权利要求3所述的FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征在于：所述步骤 (2)反应体系如下： 10Χ 扩增缓冲液 5. 0 ul ;25mMMg2+ 4. 0 ul ;10mM dATP 1. 0 ul ;10mM dTTP 1. 0 ul ;10mM dCTP 1. 0 ul ;10mM dGTP 1. 0 ul ;10mM 7-deza-dGTP 2. 0 ul ;二甲亚砜 3. 0 ul ;引物（SEQ N0.120pmol/ul)1.5uld|*(SEQN0.2 20 pmol/ul)1.0uld|*(...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅咏南，何骏奇，王校，
申请(专利权)人：上海中优医药高科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31