本发明专利技术公开了一种检测凝血酶的电化学发光生物传感器及其制备方法，该方法包括：玻碳电极预处理；在预处理的玻碳电极上涂覆二茂铁功能化石墨烯；制备Ru(bpy)32+标记的凝血酶适配体溶液；将涂覆修饰后的电极在标记后的适配体溶液中培育一段时间，即得到所述生物传感器。由于二茂铁对Ru(bpy)32+具有信号淬灭作用，该传感器处于“光信号关闭”状态。当将其浸入凝血酶检测液中后，传感器上的适配体会与凝血酶发生特异性结合，因此发生构象变化，从二茂铁石墨烯表面脱吸附，导致二茂铁光淬灭基团与Ru(bpy)32+发光基团分离，淬灭效应减弱，传感器转化为“光信号开启”状态，从而实现对凝血酶的特异性检测。本发明专利技术的生物传感器检测凝血酶时稳定性好，灵敏度高，操作简单方便。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析化学与电化学发光传感分析领域，具体涉及一种基于二茂铁石墨 烯的检测凝血酶的电化学发光生物传感器及其制备方法。
技术介绍
凝血酶是由凝血酶原活化变成的丝氨酸蛋白质水解酶（由49个氨基酸残基的轻 链和259个氨基酸残基的重链组成)，在抗凝过程中和心血管疾病治疗中（即止血和血栓)中 具有不可替代的关键作用。机体内的凝血酶浓度必须保持在一定的范围内，血液中的凝血 酶浓度过高，会引起一序列的相关疾病，因为高浓度的凝血酶会引起过度凝血，使得机体内 的血液无法正常流通，严重的凝血将有可能导致机体的直接死亡。因此，建立一种准确、快 速、高灵敏度的凝血酶检测方法或传感器，在医学研究及疾病治疗方面具有十分重要的意 义。 核酸适配体是一小段通过一个被称为指数式富集法配体演化技术（体外筛选 SELEX技术)得到的新型的DNA或者RNA单链寡核苷酸，能够与对应的配体靶分子进行高亲 和力与强特异性的结合。1998年，Potyrailo等发现将适配体作为分子识别元件固定在传 感器表面，可以成功检测出纳摩尔级的蛋白质。作为一种新型分子识别元件，与传统的抗 体和酶相比，适配体不仅容易合成和修饰，目标分子范围广，涵盖了包括蛋白质、核酸以及 其它无机、有机等分子，而且热稳定性好、维持活性的pH值和盐浓度范围广、变性和复性可 逆。因此，适配体很快成为了传感器领域炙手可热的分析工具和研究对象。到目前为止，大 量采用不同种类适配体构建的传感检测技术的研究得到了大力发展，例如，荧光传感检测、 比色法传感检测、石英晶体微天平传感检测、电化学传感检测和电化学发光传感检测技术。 由于电化学发光传感器有效结合了电化学技术和化学发光技术的优点，如灵敏度高，易于 控制等，电化学发光传感器在蛋白质检测应用方面表现出极大地优势。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种检测凝血酶的电化学发光生物传感器的制备方 法。 具体地，该制备方法包括以下步骤： (1) 对玻碳电极进行预处理； (2) 将二茂铁功能化石墨烯溶液涂覆到所述预处理后的玻碳电极表面，形成二茂铁功 能化石墨烯修饰玻碳电极； (3) 制备Ru(bpy)32+标记的凝血酶适配体溶液； (4) 将所述步骤（2)所得到修饰玻碳电极浸入所述步骤（3)得到的溶液中培育一定时 间，即得到所述的电化学发光生物传感器； 其中，所述凝血酶适配体的序列为5' -NH2-(CH2)6-TACATGTGG TTG GTGTGGTTGG-3'。 石墨烯是单层碳原子紧密堆积形成的流放蜂巢晶格结构的晶体，独特的结构使其 具有优异的电学、热学、力学及化学性质，可以作为新型的传感器材料。特别的是，由于石墨 烯和核苷酸中含氮碱基之间独特的强烈的共轭作用力，石墨烯能够有效地吸附单链 寡核苷酸。在本专利技术方法中，石墨烯可以有效地吸附所述凝血酶适配体。Ru(bpy) 32+ (三联 吡啶钌）是一种稳定的、发光效率非常高的发光剂，由于其分子量和分子空间体积较酶等标 记小很多，且不影响核酸的特异性和杂交活性，使得Ru (bpy) 32+在分子水平上对核酸进行标 记而成为可能。再加上Ru (bpy) 32+可在电化学发光（ECL)反应中进行再生循环反应，使得一 个标记物在每一个检测周期中会产生相当数量的光子，因而分析灵敏度很高。在本专利技术的 方法中，利用Ru(bpy) 32+标记凝血酶核酸适配体不仅不会影响该适配体与凝血酶结合的特 异性，而且还能增强检测反应的灵敏度。二茂铁是一种具有芳香族性质的有机过渡金属化 合物，当二茂铁存在时，其通过电子转移使Ru (bpy) 32+从激发态失活回到基态，无法产生磷 光，因此二茂铁可以作为Ru (bpy) 32+的发光猝灭剂。 通过本专利技术方法制备的电化学发光生物传感器，由于Ru(bpy)32+标记的凝血酶 适配体会吸附到石墨烯的表面，因此石墨烯上的二茂铁对Ru (bpy) 32+发光剂的猝灭得以 实现，使得该制备的生物传感器处于光信号关闭状态。当将该生物传感器浸入凝血酶 检测液中一定时间后，传感器上的适配体会与凝血酶发生特异性结合，因此适配体发生构 象变化，不再被石墨烯所吸附，从石墨烯表面脱吸附，导致二茂铁光淬灭基团与Ru (bpy) 32+ 发光基团分离，淬灭效应减弱，该生物传感器转化为光信号开启状态，从而实现对凝血 酶的特异性检测。 目前已报道有多种凝血酶适配体，其中最广泛使用的能够与凝血酶 发生不同位点特异性结合的适配体（TBA)是由15个碱基组成的核苷酸序列SEQ No. 1 : 5' -GGTTGGTGTGGTTGG-3'，已被用作传感器元件用于构建各种基于适配体的生物传感器。 本专利技术人在对多种凝血酶适配体进行试验后，发现一段由22个碱基组成的核苷酸序列SEQ No. 2 :5' -TACATGTGGTTG GTGTGGTTGG-3'，且其5'端修饰了氨基和烷基即5'-順2-(012)6-，氨基和烷基修饰是为 了标记发光基团Ru (bpy) 32+，构成的适配体应用于本专利技术时灵敏度高，特异性非常好。在 本专利技术的一个具体实施例中，步骤（1)中对玻碳电极进行预处理通过以下方式进行：将玻 碳电极用α-Α1 203抛光粉抛光；洗涤；分别在去离子水和乙醇中超声10 min。因为石墨烯 与玻碳电极之间的η-η共轭作用力使得石墨烯能够稳定修饰在玻碳电极表面，而其他材 质的电极与石墨烯之间没有作用力存在，无法在无辅助媒介条件下实现石墨烯在电 极表面的固定。 作为本专利技术所述制备方法的优选实施方式，步骤（2)中二茂铁功能化石墨烯溶液 的浓度为1. 〇?2. 0 mg ^!/1。当二茂铁石墨烯溶液浓度过低时，实现二茂铁石墨烯在电极 表面修饰后，二茂铁分子的数量不足，对发光基团Ru (bpy)32+淬灭效果不明显；当二茂铁石 墨烯溶液浓度过高时，由于修饰在电极表面的二茂铁石墨烯过多，当实现对目标物凝血酶 检测后，适配体无法从电极表面脱吸附，传感器信号无法恢复。 在本专利技术的一个具体实施例中，所述步骤（2)中二茂铁功能化石墨烯溶液的制备 方法如下： 1)在氧化石墨悬浮液中加入DCC和ED，混合均匀，在室温下超声1小时，得到棕色溶 液； 2) 使步骤1)所得的棕色溶液在70 °C、不断搅拌条件下反应24小时； 3) 将步骤2)所得的溶液进行离心，用四氢呋喃和乙醇洗涤，干燥，得到胺化石墨氧化 物； 4) 将所述胺化石墨氧化物溶解于去离子水中，超声10分钟； 5) 将二茂铁甲醛溶解于乙醇中形成二茂铁乙醇溶液； 6) 将步骤4)所得的胺化石墨氧化物溶液加入到步骤5)所得的二茂铁甲醛溶液中，在 室温、不断搅拌条件下，反应3小时后，向溶液中加入硼氢化钠，继续在室温条件下搅拌3小 时，再次加入硼氢化钠； 7) 将步骤6)所得的反应液在85 °C下搅拌反应12小时； 8) 对步骤7)所得的溶液进行离心，用乙醇和去离子水洗涤，干燥，即得到二茂铁石墨 烯； 9) 将步骤8)所得的二茂铁石墨烯溶于去离子水中超声均匀，即得到所述二茂铁石墨烯 溶液。 在本专利技术的一个具体实施例中，作为本专利技术所述制备方法的优选实施方式，步骤 (3)中Ru(bpy)32+标记本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测凝血酶的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）对玻碳电极进行预处理；（2）将二茂铁功能化石墨烯溶液涂覆到所述预处理后的玻碳电极表面，形成二茂铁功能化石墨烯修饰玻碳电极；（3）制备Ru(bpy)32+标记的凝血酶适配体溶液；（4）将所述步骤（2）所得到修饰玻碳电极浸入所述步骤（3）得到的溶液中培育40～50 min，即得到所述的电化学发光生物传感器；其中，所述凝血酶适配体的序列为5’‑NH2‑(CH2)6‑TACATGTGG TTG GTGTGGTTGG‑3’。
【技术特征摘要】
1. 一种检测凝血酶的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 对玻碳电极进行预处理； (2) 将二茂铁功能化石墨烯溶液涂覆到所述预处理后的玻碳电极表面，形成二茂铁功 能化石墨烯修饰玻碳电极； (3) 制备Ru(bpy)32+标记的凝血酶适配体溶液； (4) 将所述步骤（2)所得到修饰玻碳电极浸入所述步骤（3)得到的溶液中培育40?50 min，即得到所述的电化学发光生物传感器； 其中，所述凝血酶适配体的序列为5' -NH2-(CH2)6-TACATGTGG TTG GTGTGGTTGG-3'。2. 如权利要求1所述的电化学发光生物传感器的制备方法，其中所述步骤（1)的对玻 碳电极进行预处理通过以下方式进行：将玻碳电极用α -A1203抛光粉抛光；洗涤；分别在去 离子水和乙醇中超声10 min。3. 如权利要求1所述的电化学发光生物传感器的制备方法，其中所述步骤（2)中二茂 铁功能化石墨烯溶液的浓度为1. 〇?2. 0 mg · mL'4. 如权利要求1所述的电化学发光生物传感器的制备方法，其中所述步骤（2)中二茂 铁功能化石墨烯溶液的制备方法如下： 1) 在氧化石墨悬浮液中加入DCC和ED，混合均匀，在室温下超声1小时，得到棕色溶 液； 2) 使步骤1)所得的棕色溶液在70 °C、不断搅拌条件下反应24小时； 3) 将步骤2)所得的溶液进行离心，用四氢呋喃和乙醇洗涤，干燥，得到胺化石墨氧化 物； 4) 将所述胺化石墨氧化物溶解于去离子水中，超声10分钟； 5) 将二茂铁甲醛溶解于乙醇中形成二茂铁乙醇溶液； 6) 将步骤4)所得的胺化石墨氧化物溶液加入到步骤5)所得的二茂铁甲醛溶液中，在 室温、不断搅拌条件下，反应3小时后，向溶液中加入硼氢...
【专利技术属性】
技术研发人员：高文华，卓邦荣，陈可健，陈耀文，黄响，徐严平，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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