一株溶藻金黄杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株溶藻金黄杆菌及其在控制蓝藻水华中的应用。从太湖水体中分离获得了一株具有显著溶藻活性的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)GLY-4205，保藏号为CGMCC No.8283，并且从其发酵产物中分离纯化并鉴定出其有效溶藻成分3-异丙基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、7-羟基-3-异丁基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。上述四种溶藻物质对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50分别为3.9、0.95、2.82和5.7μg/mL。除六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮对聚球藻BN60无致死效果外，其余三种溶藻物质对聚球藻BN60的半致死量LD50分别为17.19、1.31和3.84μg/mL。可用于新型生物杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。

【技术实现步骤摘要】
一株溶藻金黄杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用
本专利技术涉及环境微生物领域，特别涉及一株具有溶藻活性的金黄杆菌 (Chryseobacterium sp. )GLY_4205及其在蓝藻水华控制中的应用。
技术介绍
近些年来湖泊富营养化导致的蓝藻水华爆发对湖泊水系的污染日益严重，太湖、 巢湖、滇池等淡水水域都受到了严重的影响。因此探索控制蓝藻生物量和抑制蓝藻水华发 生的有效途径是非常必要的。 蓝藻水华的控制技术可归纳为物理方法、化学方法和生物方法。物理方法如机械 除藻、电磁场除藻等可以作为水华爆发的辅助控制措施，但是缺点在于治标不治本，并且处 理能力有限；化学方法如除草剂等化学杀藻剂可以直接杀死藻类，但这些化学物质的专一 性差，而且容易富集在食物链中造成二次污染。 其中由于物理方法和化学方法存在上述缺陷，生物方法因其环保、经济等优点， 受到越来越多的关注。针对蓝藻的溶藻细菌（algae-lysingbacteria)是一类可以直接（菌 藻细胞接触）或者间接（分泌胞外物质）抑制灭杀蓝藻的细菌统称，它们是淡水生态环境 系统的重要组成部分，对减少蓝藻的生物量，维持生态平衡具有重要作用。 因此，本领域的技术人员致力于筛选高效溶藻细菌或分离富集溶藻细菌代谢产生 的高效溶藻活性物质，以开发微生物杀藻剂，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。
技术实现思路
鉴于现有技术中物理方法和化学方法处理能力有限、容易造成二次污染的缺陷， 本专利技术所要解决的技术问题是寻找高效溶藻细菌及分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶 藻活性物质，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。 为实现上述目的，本专利技术提供了一株具有溶藻活性的金黄杆菌及其代谢产物在蓝 藻水华控制中的应用。 本专利技术提供了 一株具从太湖水体中分离获得的有溶藻活性的金黄杆菌 (Chryseobacterium sp. ) GLY-4205，该菌株为革兰氏阴性，杆状，大小为0· 5 μ m? 1·0μπιΧ3·0μπι?4·0μπι，在液体培养基中摇床培养24h后，个另ij菌体长达8 μ m。在营养 琼脂固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，表面光滑扁平，边缘整齐，黄色，菌落 大小为2mm?3mm。经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某金黄杆 菌菌株有99%的同源性，故鉴定为金黄杆菌属细菌，命名为金黄杆菌GLY-4205。 该菌种已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号 CGMCC No. 8283,保藏日期为2013年9月27日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院中科院微生物研究所，邮编：1〇〇1〇1，电话=86-10-64807355。该菌种的16srRNA基因在 GenBank中的登录号是KC688880。 进一步地，本专利技术提供了上述金黄杆菌GLY-4205在控制蓝藻水华中的应用。 进一步地，本专利技术金黄杆菌GLY-4205在控制蓝藻水华中的应用方式可以是通过 其发酵产物，包括发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。 金黄杆菌GLY-4205发酵产物的制备步骤如下： 1)、发酵金黄杆菌GLY-4205菌株，获得发酵液； 2)、用萃取剂萃取发酵液，获得萃取液； 3)、将萃取液蒸干，获得粗提物； 4)、将粗提物溶于水后过滤； 5)、将步骤4)过滤后的滤液进一步提纯得到多组分或单一组分的有效溶藻物质， 即为发酵液提取物。 优选地，步骤1)中，发酵条件为，金黄杆菌GLY-4205接种于PH7.0的灭菌牛肉膏 蛋白胨培养基中，28 °C、200rpm环境条件下发酵48h。 优选地，步骤2)中，萃取剂为乙酸乙酯，萃取体系中乙酸乙酯与发酵液的体积比 为1: 1，混合后，放入振荡器中振荡24h，分离出的上层乙酸乙酯溶液即金黄杆菌GLY-4205 发酵液的萃取液。 优选地，步骤3)中，过滤为使用0. 22 μ m孔径滤膜过滤。 优选地，步骤4)中，进一步提纯手段为柱层析，具体为：将滤液通过半制备柱，用 HPLC进行初步纯化，得到溶藻成分；将得到的溶藻成分通过分析柱，用HPLC进行进一步纯 化，得到四种具有溶藻活性的有效成分4205-A、4205-B、4205-C和4205-D。 金黄杆菌GLY-4205的代谢产物中有效的溶藻成分的化学结构通过UPLC-ESI-MS 、GC-EI-MS和NMR分析获得。 有效溶藻成分4205-A的分子尚子峰为197. 1285m/z，样品分子量 为196. 1212，分子式为C1(iH16N202，核磁共振谱结果是^NMRGOOMHlCDCI^ δ 6. 37 (1Η, s, N-H), 4. 06 (1H, t, J = 7. 5Hz, H-6), 3. 92 (1H, s, H-9), 3. 62 (1H, m, H-3a), 3. 5 4 (1H, dt, J = 8. 9, 2. 6Hz, H-3b)，2. 61 (1H, m, H-10)，2. 45-2. 28 (1H, m, H-5a)，2. 14-1. 97 (2 H，m, H-4a, H-5b)，1. 93-1. 86 (1H, m, H-4b)，1. 06 (3H, d, J = 7. 2Hz, H-ll)，0· 90 (3H, d, J = 6. 8Hz, H-12) ; 13H NMR(101MHz, CDC13) δ 164. 93 (C-7)，45. 07 (C-3)，22. 31 (C-4)，28. 35 (C-5) ，60. 38 (C-9)，170. 13 (C-l)，58. 76 (C-6)，28. 48 (C-10)，16. 01 (C-ll)，19. 11 (C-12)。 有效溶藻成分4205-B的分子尚子峰为227. 1390m/z，样品分子量为 226. 1319,分子式为 CnH18N203，核磁共振谱结果是屮 NMR(400MHz, dimethylsulphoxi de-d6 (DMS0-d6)) δ 8. 00 (1H, s, N-H), 5. 09 (1H, d, J = 2. 8Hz, 4-〇H), 4. 39 (1H, dd, J = 10. 6, 6. 7Hz, H-4), 4. 28 (1H, d, J = 2. 8Hz, H-9), 4. 05 (1H, t, J = 6. 1Hz, H-6), 3. 48 (1H, dd, J =12. 3, 4. 4Hz, H-3a), 3. 23 (1H, dd, J = 12. 4, 3. 0Hz, H-3b), 2. 04 (1H, dd, J = 13. 0, 6. 7Hz, H-5a), 1. 98-1. 82 (2H, m, H-10), 1. 77 (1H, ddd, J = 13. 5, 8. 3, 5. 0Hz, H-ll), 1. 42-1. 25 (1H, m, H-5b), 0· 87 (6H, dd, J = 6. 5, 2. 6Hz, H-12, H-13) ;13C NMR(101MHz, D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株具有溶藻活性的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)GLY‑4205，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8283，保藏日期为2013年9月27日。

【技术特征摘要】
1. 一株具有溶藻活性的金黄杆菌（Chryseobacterium sp.)GLY-4205,保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 8283,保藏日期为2013年9月27 曰。2. 如权利要求1所述的金黄杆菌GLY-4205在控制蓝藻水华中的应用。3. 如权利要求1所述的金黄杆菌GLY-4205的发酵产物在控制蓝藻水华中的应用。4. 具有结构式（I )、（ II )或（III)所示结构的化合物在控制蓝藻水华中的应用。5. -种溶藻菌剂，其特征在于，所述溶藻菌剂中包含权利要求1所述的金黄杆菌 (Chryseobacterium sp. )GLY_4205〇6. -种溶藻药剂，其特征在于，所述溶藻药剂中包含权利要求1所述的金黄杆菌 (Chryseobacterium sp. )GLY-4205的发酵产物，所述发酵产物为发酵液、发酵液浓缩物、发 酵液粗提物或发酵液提取物。...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨虹，郭星亮，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31