一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，属真菌分子生物检测技术领域，其特征在于包括如下步骤：（1）提取待测烟曲霉菌株的总DNA；（2）选取RPB2基因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条；（3）待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增；（4）琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。本发明专利技术的检测方法能快速鉴定出烟曲霉菌，具有快速、准确、高效的优点。

【技术实现步骤摘要】

： 本专利技术涉及，属真菌分子生物检测
。
技术介绍
： 真菌存在于几乎所有的陆地和水生生态系统中，与人类生产活动和生活关系密 切。许多真菌具有重要的经济意义，但也有些种类的真菌会引起植物、动物和人类的病害或 产生毒素，会危害人类的健康。 烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus)是自然界中广泛存在的腐生真菌，也是重要 的机会致病菌。随着免疫受损人群的增多，系统性曲霉病的90%是由烟曲霉菌引起的。同 时，烟曲霉菌产生的毒素严重污染粮食与饲料制品，危害人和动物的健康，造成重大的经济 损失，烟曲霉菌已成为临床医学和医学微生物家们关注的热点。 烟曲霉菌的检测技术经历了传统培养鉴别、层析法及色谱法等化学方法检测、免 疫学检测、分子生物学检测等。 近年来，随着高效基因扩增平台、引物设计方案以及定量扩增技术的发展和应用， 包括真菌在内的微生物快速检测与鉴定对于病害诊断、监测和防治具有重要意义。
技术实现思路
： 为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种快速鉴定烟曲霉菌的检测 方法，具有快速、准确、高效的特点。 本专利技术是通过如下技术方案来实现上述目的的。 本专利技术提供的，包括如下步骤： (1)提取待测烟曲霉囷株的总DNA ; _〇] (2)选取RPB2基因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条，分别为： 1)引物名称 F2255,引物序列 CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG ; 2)引物名称 R3044,引物序列 TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT ; 3)引物名称 R3438,引物序列 CTGCCGGGTCAGAATCTGT ; (3)待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增； (4)琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。 本专利技术与现有的技术相比具有如下有益效果： 本专利技术基于已公布的曲霉属真菌烟曲霉、棒曲霉、费氏曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、黑 曲霉、米曲霉和土曲霉等的基因组序列，通过基因组同源性分析，选择RPB2基因作为研究 对象，根据RPB2基因存在的12个保守区域的序列比对结果和变异位点，筛选出可用于烟曲 霉快速鉴定的特异性引物。通过设计3条引物，对待测烟曲霉菌株的目的基因片段进行PCR 扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测方法判断待测菌株是否为烟曲霉菌。 【具体实施方式】： 下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。 1、待测曲霉菌株的培养 待测曲霉菌样品来源于中国科学院微生物研究所、北京大学真菌和真菌病研究中 心、吉林大学真菌研究中心，接种至PDA培养基上，置培养箱28°C培养。 2、待测曲霉菌株的DNA提取 挑取直径5mm的曲霉菌株菌丝块接种至100ml 液体培养基中，室温下摇床培养 (250rpm) 2-4周，收集菌体并用无菌生理盐水冲洗数次，灭菌滤纸吸干。取0. lg菌体在液 氮中迅速研磨成粉末，用2%(w/v) CTAB缓冲液抽提DNA，0. 8%琼脂糖凝胶检测DNA样品。 3、目的片段PCR扩增 PCR反应在ABI2720PCR仪（美国加州ABI公司）上进行，25 μ 1反应体系包 括：超纯水 17.5yl，10Xbuffer2.5yl，引物（ΙΟμΜ)各 Ιμ?，TaqDNA 聚合酶（1.25U/ μ 1)0. 5μ 1，dNTP(2. 5πιΜ)1μ 1，模板 DNAly 1。 PCR反应条件为：94° C预变性4min;94° C变性30s，66° C(或64° C)退火 30s，72° C 延伸 45s，30 个循环；72° C 延伸 7min。 引物列表： 引物名称引物序列(5' -3'） F2255 CCMCAAGCGTGTTCGTTCAG R3044 TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT R3438 CTGCCGGGTCAGAATCTGT 4、琼脂糖凝胶电泳检测 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，引物F2255-R3044和F2255-R3438的扩增产 物分别约800bp和1200bp。 5、序列测定验证 目的片段PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司，ABI3730XL测序仪双 向测序。 弓丨物F2255/R3044扩增烟曲霉得到的序列为790bp : CCAACAAGCGTGTTCGTTCAGTCCTCAGTCAAAAGGCACACACTTGGACGCATTGCGAGATTCACC CCAGTATGATTCTTGGTGTTTGTGCCAGTATCATTCCCTTCCCGGACCACAACCAGTCGCCTCGTA ATACCTACCAGTCTGCAATGGGCAAACAAGCCATGGGTGTGTTTTTGACCAACTTTGACCAACGAA TGGAGACAATGGCAAATATTCTCTATTACCCGCAGAAACCGCTAGCCACAACACGGTCCATGGAAT TCCTTCGATTCCGTGAACTACCAGCTGGGCAGAATGCCATCGTCGCCATTGCTTGCTACTCCGGAT ACAACCAAGAAGATTCGGTCATCATGAACCAGAGCAGCATCGATCGTGGTCTCTTCCGAAGTCTCT TCTATCGCACATACACGGATAGCGAGAAAATGGTTGGCCTGACTGTTGTCGAGCGGTTTGAGAAGC CCATGCGCTCGGATACGATCGGTATGAGAAAGGGCACCTACGATAAGCTCGATGAGGACGGTATCA TTGCCCCTGGTGTGCGTGTCTCCGGAGAGGATATTATCATCGGCAAGACCGCCCCGTTGGCACCCG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，其特征在于包括如下步骤：（1）提取待测烟曲霉菌株的总DNA；（2）选取RPB2基因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条；（3）待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增；（4）琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。

【技术特征摘要】
1. 一种快速鉴定烟曲霉菌的检测方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 提取待测烟曲霉囷株的总DNA ; (2) 选取RPB2基因作为分子标记，即目的片段，设计特异性引物3条； (3) 待测烟曲霉菌株目的片段PCR扩增； (4) 琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判断待测菌株是否为烟曲霉菌。2. 根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：余知和，曾昭清，周建芬，程云方，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42