本发明专利技术提供一种利用噬菌体表面展示技术筛选获得的人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体M5，其轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。该抗体能够特异性识别H7N9病毒颗粒抗原，可与H7N9病毒发生显著的酶联免疫反应且具有抗H7N9病毒感染的中和活性功能。此外，可将本发明专利技术的抗体制成预防和治疗H7N9禽流感病毒的特异性抗体药物，从而在临床中用于预防和治疗由H7N9病毒引起的急性呼吸道传染病。
【技术实现步骤摘要】
人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体M5、其制备方法及应用
本专利技术涉及基因工程及噬菌体表面展示技术，具体地说，涉及人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体M5、其制备方法及应用。
技术介绍
H7N9禽流感是由H7N9禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病。自2013年2月以来，上海市、安徽省、江苏省先后发生不明原因重症肺炎病例。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39°C以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速发展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等，死亡率较高。由H7N9病毒引起的急性呼吸道传染病目前没有相应的疫苗和特异性药物，因此制备高效、价廉、副反应小的被动免疫制剂成为研究的热点。利用含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白来预防和治疗传染病由来已久。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护机体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如汉坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、狂犬病毒等中和性单克隆抗体可以在体内100%保护动物免受病毒攻击。免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)作为抗体成分主要来自捐献者(恢复期病人)免疫血清，从获得阳性血清到通过安全性检测耗时较长，且需投入大量的人力和财力，这就使其大量制备受到限制，同时由于抗体主要来源于血清，因此容易发生血源性传播疾病的感染。而使用人源基因工程产品替代血制品则可克服这些缺陷，随着人源基因工程抗体研究的不断深入，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和广阔前景。90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术(Barbas, C.F.等，1991)和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，极大促进了人源或基因工程抗体的开发研究，并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。人源抗病毒基因工程抗体，尤其是人源全抗体的研究成功，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗开辟了新思路，并在抗病毒感染生物医药领域中逐渐开发出一类新的抗病毒药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体M5、其制备方法及应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体M5或其活性片段，其轻链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如表1所示:表1轻链和重链高变区的氨基酸序列CDRlCDR2CDR3重链 VHSYAMS￥IYSA(3SSTYYADSVK(3 SYGLDYYGSGSYYNYFDY 轻撻 VL RASQYIDSSHLAGASGRATQQFERSSVT前述的中和性抗体M5，i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术中所述的人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体M5的活性片段是指能够与抗原结合的人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体M5的Fab段。本专利技术还提供编码所述人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体M5的基因。其中，编码轻链可变区和编码重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。本专利技术还提供含有编码所述人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体M5的基因的载体及宿主细胞。本专利技术还提供一种制备人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体方法，利用噬菌体表面展示技术，采集多个H7N9禽流感病人恢复期外周血淋巴细胞，通过基因工程方法构建了人源抗H7N9禽流感病毒 基因工程抗体文库，并筛选获得特异性抗H7N9禽流感病毒的基因工程抗体Fab段。该抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的，并能够在原核细胞中获得有效表达的特异性结合H7N9禽流感病毒的功能性抗体。它特异性识别H7N9禽流感病毒颗粒抗原，与H7N9禽流感病毒具有明显的酶联免疫(ELISA)反应和抗H7N9禽流感病毒感染的中和活性功能。H7N9禽流感M5特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗H7N9禽流感病毒抗体基因库的特异性富积筛选，该抗体库的建立来源于中国H7N9禽流感病毒病人外周血淋巴细胞基因。其轻链和重链可变区相应的三个CDR区序列组合及其CDR区之间的框架区序列构成了该抗体可变区序列特征，H7N9禽流感M5属于抗体轻链家族VK3。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列及其互补序列所决定，6个相应的CDR区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，决定了本专利技术抗体的抗原结合特征和抗H7N9禽流感病毒功能特征。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述Fab段抗体的基因序列进行改造，获得编码具有相同功能的抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。进一步地，本专利技术将上述Fab抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组，获得分子量更小的单链抗体(ScFv)，该抗体同样能够特异性识别H7N9禽流感病毒表面抗原，具有细胞内免疫的作用。单链抗体穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。参照朱进，王辛，焦永军，冯振卿，曹伯良，管晓虹.高亲和力抗Met人源基因工程抗体scFv的筛选与特性分析[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2006，6:417-422。可将上述编码Fab抗体的基因、ScFv基因克隆到表达载体中，进而转化宿主，通过诱导表达获得Fab抗体以及单链抗体。此外，可将上述Fab抗体的轻链编码基因和重Fd段基因克隆到全抗表达载体中，并导入宿主细胞中，获得表达抗H7N9禽流感病毒的全抗免疫球蛋白。参照 Christoph Rader, MikhaiI Popkov, John A.Neves,and Carlos F.Barbas II1.1ntegrinαVβ 3-targeted therapy for Kapos1.s sarcoma with an in vitro-evolvedantibody.The FASEB Journal.(0ctoberl8, 2002) 10.1096/fj.02_0281fje。利用ELISA、SDS-PAGE、中和实验等方法对获得的Fab抗体(即中和性抗体M5)进行功能鉴定，结果表明人源Fab抗体M5针对H7N9病毒A/Anhui/1/2013株病毒颗粒均有特异性结合，利用中和实验对Fab抗体进行功能鉴定，结果表明人源Fab抗体M5具有较好的中和活性。本专利技术还提供所述中和性抗体M5或其活性片段在制备预防或治疗由H7N9禽流感病毒引起的疾病，特别是呼吸道疾病的药物中的应用。本专利技术进一步含有所述中和性抗体M5或其活性片段的药物或检测试剂。本专利技术利用噬菌体表面展示技术，成功筛选获得了特异性针对H7N9禽流感病毒的人源中和性抗体M5 ;利用上述获得的人源中和性抗H7N9禽流感病毒基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及基于该抗体基因的全抗体基因，可以在原本文档来自技高网...
【技术保护点】
人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体M5或其活性片段，其特征在于，其轻链及重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下表所示：
【技术特征摘要】
2013.08.02 CN 201310333787.91.人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体M5或其活性片段，其特征在于，其轻链及重链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如下表所示: 2.根据权利要求1所述的中和性抗体M5，其特征在于， i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及 ?)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。3.编码权利要求2所述中和性抗体M5的基因。4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，编码轻链可变区和重链可变...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈哲，金奇，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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