一种高质高效的多酚多糖类植物样品RNA提取方法技术

本发明专利技术涉及一种多糖多酚类植物样品RNA的提取方法，结合CTAB法和OMEGA试剂盒所提供的商业试剂盒，开发了一种高效率高质量的RNA提取方法，经过检验在黄梁木(Neolamarckia cadamba)、茶树(Camellia sinensis L.)、枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)、月季(Rosa chinensis)、荔枝(Litchi chinensis Sonn.)、银杏(Ginkgo biloba L.)、仙人掌(Opuntia ficus-indica L.)、火炬松(Pinus taeda L.)、芦荟(Aloe barbadensis Mill.)、红豆杉(Taxus media)等植物各组织中都可以使用，效果良好，为今后分子生物学实验中RNA的提取制备提供了一个良好的选择。

【技术实现步骤摘要】
一种高质高效的多酚多糖类植物样品RNA提取方法
本专利技术属于分子生物学
，具体地说，本专利技术涉及一种高效率高质量的植物RNA提取方法。
技术介绍
提取高质量的，没有多糖、多酚、基因组DNA、蛋白质或者其它次生代谢物质污染的RNA对于研究植物生长发育过程中基因的功能和表达方式等很多后续的实验都至关重要，比如反转录PCR，实时定量PCR，cDNA文库构建，Northern印迹杂交和RNA-seq等。酚类很容易被氧化成为醌类，而醌类会和蛋白质及核酸发生不可逆转的结合。而多糖类物质可以和RNA共沉淀，降低RNA的纯度，影响在下游实验中的使用。现在市场上常用的商业RNA提取试剂盒，比如Takara，Promega和Omega等对多酚多糖类植物RNA提取也有较强的局限性。使用CTAB法可以部分克服多糖多酚类物质的干扰，但是CTAB法费时费力，经常会造成RNA的降解。以此，我们结合使用CTAB裂解液裂解和试剂盒吸附柱纯化的方法，专利技术了一种高效的在多酚多糖植物样品中提取高质量RNA的方法。
技术实现思路
本专利技术针对目前分子生物学研究中对高质量植物RNA的需求，开发了一种高效率高质量提取含多酚多糖类植物样品RNA的方法。本专利技术技术方案如下，主要特点是：A裂解：液氮研磨后的样品100mg加入经过60℃预热的CTAB裂解液600μl，同时加入12μl的β-巯基乙醇，涡旋振荡2min，60℃裂解10min，期间上下颠倒混匀数次，B抽提：加入600μl按照24:1混匀的氯仿：异戊醇，涡旋震荡2min离心10min吸取上清后再次用上述氯仿：异戊醇抽提离心10min(对于芽、嫩叶等色素或者其它代谢物质丰富的组织器官要适当增加离心时间，比如黄梁木(Neolamarckiacadamba)的芽离心20min效果最佳)。所述裂解液的配制：2％CTAB,2％PVPK-40,100mMTris-HCl(pH8.0),25mMEDTA(pH8.0),2.0MNaCl,2g/L亚精胺。本专利技术的高效率高质量的多酚多糖类植物组织RNA提取方法，可以快速提取多酚多糖类植物组织样品的RNA，并且纯度高，无降解，可以直接用于下游实验。附图说明图1为使用该方法提取的常见多酚多糖类植物样品的RNA电泳图。图2为使用该方法提取的黄梁木各组织RNA电泳图。图3为使用该方法提取的常见多酚多糖类植物样品的RNA浓度及OD值。图4为使用该方法提取的黄梁木各组织RNA浓度及OD值。具体实施方式结合实施例对本专利技术进行详细说明。实施例一黄梁木叶片RNA的提取采取一年生黄梁木(株高1.5m，地径2.1cm)中上部成熟的叶片，迅速放入液氮速冻，研磨成微小的颗粒放入1.5ml无RNase污染的离心管中，每管样品约100mg。提前配制的CTAB裂解液经60℃预热后，吸取600μl加入样品中，同时加入10μl的β-巯基乙醇，涡旋振荡两分钟后60℃恒温裂解10min，期间颠倒混匀数次。加入按24:1混匀的氯仿：异戊醇抽提液600ul，涡旋振荡2min，4℃14，000xg离心10min。吸取上清液到一个新的离心管中再次加入600ul的抽提液涡旋振荡2min，4℃14，000xg离心10min。吸取上清到一个新的离心管中，加入500ul的BufferRB，和500ul无水乙醇，颠倒混匀。将上述溶液转移到HibindRNAMinicolumn上，常温10,000xg离心1min，弃去滤液。吸附柱上加入300ulRWCwashBuffer，常温10,000xg离心1min，弃去滤液。在吸附柱膜的中央滴入混合好的DNaseⅠ消化液75ul(使用时现配，1.5ulRNase-freeDNaseⅠ和73.5ulOBIDNaseⅠDigestionBuffer)，室温(25℃-30℃)孵育15min。将吸附柱转移至一个新的收集管中，加入400ulRWCwashBuffer，室温放置5min，常温10,000xg离心1min，弃去滤液。在吸附柱上加入500ulRNAwashBufferⅡ常温10,000xg离心1min，弃去滤液(RNAwashBuffer使用前需要按照说明书使用无水乙醇稀释)。重复上述步骤。倒出滤液，空管常温10,000xg离心2min。将吸附柱放入新的1.5ml无RNase污染的离心管上，加入40ulDEPCwater到膜中央，室温放置2min，10,000xg离心1min。将离心管收集到的溶液重新吸取到吸附柱上，室温放置2min，10,000xg离心1min。弃去吸附柱，保存离心管待用。使用核酸蛋白检测仪及电泳仪检测浓度、纯度及完整度。备注：以上步骤所用BufferRB，HibindRNAMinicolumn，RWCwashBuffer，RNase-freeDNaseⅠ，OBIDNaseⅠDigestionBuffer，RNAwashBufferⅡ，DEPCwater等试剂及材料均来自Omega产品PlantRNAKit，其它试剂及材料为常规试剂耗材。实施例二黄梁木叶芽RNA的提取本实例中将实例一步骤中氯仿：异戊醇抽提离心的时间由10min改为20min，其它相同。上述实例检测结果见附图。以上结合附图对本专利技术的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本专利技术的范围，本专利技术的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本专利技术权利要求基础上的改动都是本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术所述的一种高质高效的多酚多糖类植物组织RNA提取方法，其主要特征在于：A裂解：液氮研磨后的样品100mg加入经过60℃预热的CTAB裂解液600μl，同时加入10μl的β‑巯基乙醇，涡旋振荡2min，60℃裂解10min，期间上下颠倒混匀数次。B抽提：加入600μl按照24:1混匀的氯仿：异戊醇，涡旋震荡2min离心10min吸取上清后再次用上述氯仿：异戊醇抽提离心10min(对于芽、嫩叶等色素或者其它代谢物质丰富的组织器官要适当增加离心时间，比如黄梁木(Neolamarckia cadamba)的芽离心20min效果最佳)。所述裂解液的配制：2％CTAB,2％PVP K‑40,100mM Tris‑HCl(pH8.0),25mM EDTA(pH8.0),2.0M NaCl,2g/L亚精胺。本专利技术所述的高质高效的多酚多糖类植物组织RNA提取方法，可以快速提取多酚多糖类植物组织样品的RNA，并且纯度高，无降解，可以直接用于下游实验。

【技术特征摘要】
1.一种黄梁木的芽RNA提取方法，其主要特征在于：A裂解：液氮研磨后的样品100mg加入经过60℃预热的CTAB裂解液600μl，同时加入10μl的β-巯基乙醇，涡旋振荡2min，60℃裂解10min，期间上下颠倒混匀数次；B抽提：加入600μl按照24:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊成，欧阳昆唏，黄浩，陈晓阳，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44