TGF-R反义序列及其在制备抗气道炎症反应药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程及制药领域，公开了TGF-R反义序列及其在制备抗气道炎症反应药物中的应用。该TGF-R反义序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该反义序列能使气道炎症细胞浸润明显减少，可用于制备抗气道炎症反应药物。

【技术实现步骤摘要】
TGF-R反义序列及其在制备抗气道炎症反应药物中的应用
本专利技术属于基因工程及制药领域，涉及TGF-R反义序列及其在制备抗气道炎症反应药物中的应用。
技术介绍
支气管哮喘是常见的儿童慢性疾病，近年来患病率呈显著上升趋势。1990年中国儿童支气管哮喘的患病率为0.91%，2000年上升为1.5%。根据世界卫生组织推测，目前全世界有3亿人患支气管哮喘。2005年，全世界因支气管哮喘死亡的人数约为25.5万，其中80%发生在发展中国家。支气管哮喘所带来的经济负担已超过肺结核与艾滋病的总和。因此进一步研究支气管哮喘的发病机制有着迫切的现实需求。TGF-β /[目号通路是细胞中关键的/[目号通路之一，影响了细胞的各种生命活动，包括细胞增殖、分化、凋亡等。呼吸道上皮细胞中TGF-β信号通路的阻断可能抑制了免疫反应中上皮细胞和免疫细胞之间的通讯，继而导致炎症反应的降低。 TGF-β是一个具有多种生物活性的细胞因子，在支气管哮喘发病中起多种作用。首先TGF-β可调节淋巴细胞的许多反应，是免疫应答的调节信号，可调节呼吸道的免疫反应，调节呼吸道炎性反应。其次TGF-β刺激某些类型细胞生长，如刺激成纤维细胞生长，是致纤维化的重要细胞因子，与支气管哮喘呼吸道重塑的关系密切。高水平的TGF-β可引起呼吸道重塑，其作用机制为:1、TGF-β促进SMA和杯状细胞增生肥大，增加胶原和纤连蛋白合成，并促进其在细胞外基质沉积，导致管腔狭窄和不可逆的肺功能改变。2、TGF-13减少细胞表面血浆酶的生成，大量增加血浆酶原激活物抑制剂I型抗原的合成，减弱了其裂解纤维素，参与呼吸道修复和重建的作用。3、TGF-13间接通过抑制蛋白激酶网络中的某些成分，减少细胞外基质的降解。TGF-β发挥生物学功能时，首先与细胞膜表面的TGF-R(TGF-β受体)结合，引发受体后反应产生一系列的生物学反应。因此可以通过干预TGF-R，实现对TGF-β通路的调节，从而干预支气管哮喘的发病。反义序列是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义序列特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达。利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡聚核苷酸，这是反义序列最普遍的应用方式。反义序列作为基因治疗药物之一，与传统药物相比具有诸多优点。1、高度特异性；2、高生物活性、丰富的信息量；3、高效性；4、低毒、安全。虽然反义技术是比较成熟的技术，但是在实际应用中反义序列存作用效率在问题，并非所有的反义序列都有明显的作用效率。反义序列干预的关键之处在于寻找到高效率的序列。但目前没有高效的TGF-R反义序列的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种TGF-R反义序列。该反义序列能高效抑制气道炎症。本专利技术的另一个目的是上述TGF-R反义序列在制备抗气道炎症反应药物中的应用。本专利技术的目的是通过下列技术措施实现的:一种基因，该基因为TGF-R的反义序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。即所述的 TGF-R 反义序列是 SEQ5’ -AGC AGC CCC CGA CCC ATG GC-3’。所述的基因在制备抗气道炎症反应药物中的应用。本专利技术的有益效 果:我们通过生物信息学设计TGF-R mRNA的反义序列，核酸序列:5’ -AGC AGC CCCCGACCCATGGC-3’。该反义序列能高效的抑制支气管哮喘的气道炎症。该序列不是生物体内自然存在的序列，现有文献中未见该序列的功能报道。本专利技术通过生物信息学设计出自然界不存在的TGF-R反义序列，并对其进行功能研究，在OVA (卵清蛋白)诱导的支气管哮喘小鼠模型的应用TGF-R反义序列后BALF (肺泡灌洗液)中细胞总数及嗜酸性粒细胞均下降。应用TGF-R反义序列后OVA诱导的支气管哮喘小鼠模型组的气道炎症细胞浸润明显减少。因此，TGF-R反义序列能抑制支气管哮喘的气道炎症，可用于制备抗气道炎症反应的药物。【附图说明】图1是TGF-R反义序列下调BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞。图2是TGF-R反义序列减少OVA诱导的支气管哮喘小鼠模型组的气道炎症细胞浸润。【具体实施方式】以下通过实施例对本专利技术作进一步的阐述，但不限制本专利技术。实施例1[0021 ] 一、TGF-R反义序列的获得应用RNAstructure 软件选择 TGF-R mRNA (GenBank:NC_000070.6)中不稳定部位。针对TGF-R的不稳定区预测靶位点，并避免:四个连续的G ;六个以上的回文结构。TGF-R 反义序列是 SEQ5’ -AGC AGC CCC CGA CCC ATG GC-3’ (SEQ ID N0.1)。二、TGF-R反义序列的合成实验中采用的TGF-R反义序列SEQ5’ -AGC AGC CCC CGA CCC ATG GC-3’由上海生工生物公司合成。三、OVA诱导的支气管哮喘小鼠模型的制备在O天及14天两个时间点给BALB/c小鼠腹腔注射致敏剂(0.2ml的PBS缓冲液含20ug0VA+2mg铝佐剂)。在第27天开始激发，将小鼠置于密闭容器中雾化吸入PBS缓冲液配制的1% OVA (sigma,美国)，每次雾化30min。连续激发4天,处死小鼠,取肺组织待检。四、气溶胶转染TGF-R反义序列及错义对照序列在实验的第27、28、29、30天，将小鼠置于密闭容器中雾化吸入PBS缓冲液配制TGF-R反义序列(3mg TGF-R反义序列溶解于3ml的PBS缓冲液中，0.1 % w/v)。雾化流量6ml/分。每天雾化吸入一次,每次30分钟。单独个体使用反义序列量为100mg/kg/天。在实验的第27、28、29、30天，将小鼠置于密闭容器中雾化吸入PBS缓冲液配制错义对照序列(3mg错义对照序列溶解于3ml的PBS缓冲液中，0.1 % w/v)。雾化流量6ml/分。每天雾化吸入一次，每次30分钟。单独个体使用错义对照序列量为100mg/kg/天。实验中作为对照的错义对照序列为SEQ5’-CG GTA CCC AGC CCC CGA CGA-3’ (SEQ IDN0.2，该序列的设计根据研究惯例，使用TGF-R反义序列的反向序列)五、分组说明对照组:为正常饲养组。哮喘模型组:为雾化吸入OVA组。TGF-R反义序列:吸入OVA加TGF-R反义序列错义对照序列:吸入OVA加错义对照序列六、小鼠肺泡灌洗及组织病理麻醉小鼠之后，进行颈部解剖，暴露气管，从气管处灌入PBS液0.8ml，灌洗三次，每次灌洗时反复抽吸3次。取20 μ L细胞计数板进行计数。取灌洗液涂片后待玻片自然晾干，然后置于10%中性甲醛溶液中固定10分钟以上，随后进行常规HE染色。染色后就可以进行细胞分类计数。肺组织在4%多聚甲醛中固定24小时，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜观察。研究发现，应用TGF-R反义序列后BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞均较支气管哮喘组显著下降(图1)。应用TGF-R反义序列后气道炎症细胞浸润明显少于支气管哮喘组(图2)。图1:支气管哮喘小鼠模型组，BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞数显著增高。采用TGF-R反义序列后，BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞均下降(η = 6，*0VA组比对照组，Ρ〈0.05 ;#0VA+TGF本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因，其特征在于该基因为TGF‑R的反义序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种基因，其特征在于该基因为TGF-R的反义序列，其核苷酸序列如SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵德育，刘峰，田曼，唐珩，雷其洪，王全，秦厚兵，
申请(专利权)人：南京医科大学附属南京儿童医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32