基于酞菁钴标记电化学检测有机小分子的方法技术

本发明专利技术涉及电化学检测技术领域，具体而言，特别涉及一种基于酞菁钴标记检测有机小分子的电化学方法。该基于酞菁钴标记电化学检测有机小分子的方法，包括以下步骤：a)、以一种具有类过氧化氢酶催化活性的酞菁钴标记待测物的类似物作为标记待测物分子；b)、通过聚合反应，将分子印迹聚合物包覆在磁性纳米粒子表面，并将其分散在反应液中；形成竞争性特异结合反应以及电化学检测步骤等。本发明专利技术特别适合于抗体难于制备的小分子检测，且由于采用的材料均为人工化学合成的仿生材料，大大降低了成本，扩大了检测反应的适宜范围，较传统免疫分析方法具有很大的优势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及电化学检测
，具体而言，特别涉及一种基于酞菁钴标记检测有机小分子的电化学方法。
技术介绍
在目前的生物医药检测领域，对于环境污染物、农药、激素、抗生素等小分子的高灵敏度定量免疫检测已成为广大研究人员关注的焦点问题之一。为了实现微量或痕量的小分子化合物的高灵敏度检测，各种基于生物特异性反应，如抗原抗体技术、蛋白配体技术等不同的方法和体系已经被建立。其中，具有典型性的是竞争性免疫检测技术，其利用标记抗原和待测分析物对抗体的竞争，通过检测被抗体吸附的标记抗原可以推断出体系中含有的待测分析物的浓度。但此种免疫检测方法的核心材料抗体通常制备周期长，且难以获得。分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)是人工设计的一类功能高分子材料，它可以实现对农药分子的选择性识别及富集。分子印迹聚合物是以“锁-钥匙”假说为理论基础，通过模板分子、功能单体和交联剂在发生聚合反应时形成特定的三维空间结构。在聚合物内部就形成了特定形状的空穴，由于这些空穴中含有能够与模板分子形成特异性作用的基团或结合位点，以及在三维空间结构上空穴与模板分子的匹配性，生成的分子印迹聚合物就对模板分子具有特异型识别的能力和良好的亲和性。这种分子印迹聚合物不仅有类似酶和抗体的特异性识别能力，还具有酶和抗体不具备的相当程度上的化学、物理稳定性，能够耐受酸、碱、高温、有机溶剂等环境因素的影响，且具有制备简单，可重复使用、使用寿命长等优点(谭天伟，2010)。在本专利技术中采用分子印迹聚合物作为抗体的仿生替代物，用于竞争性结合反应。在竞争性免疫反应中，经常采用辣根过氧化物酶(HRP)等酶标记催化过氧化氢分解，氧化还原性底物显色或产生电化学信号进行检测。但由于酶是生物大分子，对温度、溶剂等外部条件要求严格，限制了其应用范围。因此，提供一种基于酞菁钴标记竞争结合磁性分子印迹聚合物检测有机小分子化合物的电化学检测体系，以克服相关技术中所需酶由于对外部条件的要求较高而导致的缺陷，并为环境污染物、农药、激素、抗生素等小分子的高灵敏度快速定量检测提供一种新的检测模式是本领域亟待解决的一个技术问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种，以克服现有上述技术问题。本专利技术实施例提供的这种，包括以下步骤:a)、以一种具有类过氧化氢酶催化活性的酞菁钴标记待测物的类似物作为标记待测物分子；b)、通过聚合反应，将分子印迹聚合物包覆在磁性纳米粒子表面，并将其分散在反应液中；C)、在反应液中加入步骤a)中制得的标记待测物和待测目标物后，标记待测物与待测目标物竞争磁性分子印迹聚合物表面结合位点，形成竞争性特异结合反应；d)、通过磁铁分离，将磁性印迹聚合物及其吸附的目标物分离至试管底部，吸取上清，在其中加入含有对苯二酚和过氧化氢的溶液，通过差分脉冲伏安法，电化学检测体系中的氧化电流信号进而对待测物实现定量测量。该检测方法采用酞菁钴代替了生物酶分子标记小分子抗原，并结合磁性分子印迹聚合物进行竞争性特异性结合反应，通过电化学检测标记抗原对于过氧化氢和对苯二酚的催化氧化反应产生的电信号，由于其电信号大小与待测小分子浓度呈线性相关，可实现对小分子化合物的高灵敏度定量检测。本专利技术利用磁性分子印迹聚合物特异性结合并快速分离富集小分子化合物，并借助酞菁钴的仿生催化活性实现小分子化合物的快速高灵敏检测。本专利技术特别适合于抗体难于制备的小分子检测，且由于采用的材料均为人工化学合成的仿生材料，大大降低了成本，扩大了检测反应的适宜范围，较传统免疫分析方法具有很大的优势。可选的，在步骤b)中；所述将分子印迹聚合物为:二氧化硅；所述磁性纳米粒子为:磁性四氧化三铁微粒。可选的，在步骤c)中；在反应液中加入步骤a)中制得的标记待测物和待测目标物后，振荡吸附30分钟。可选的，在步骤c)中；反应液与标记待测物的体积比为50:1。可选的，在步骤d)中；在所述的电化学检测中，以玻碳电极为工作电极、钼片电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极。【附图说明】图1为本实施例一的酞菁催化电化学检测三嗪差分脉冲伏安图；图2为本专利技术实施例一中的检测方法中，待测物浓度数据(ppm)对电流mV的线性关系图。【具体实施方式】本专利技术提供了一种；该检测方法采用酞菁钴代替了生物酶分子标记小分子抗原，并结合磁性分子印迹聚合物进行竞争性特异性结合反应，通过电化学检测标记抗原对于过氧化氢和对苯二酚的催化氧化反应产生的电信号，由于其电信号大小与待测小分子浓度呈线性相关，可实现对小分子化合物的高灵敏度定量检测。另外，需要指出的是，在本专利技术的所有实施例中，优选的，可以具备以下一个或者多个限定条件(结合权利要求1的给出的技术方案):可选的，在步骤b)中；所述将分子印迹聚合物为:二氧化硅；所述磁性纳米粒子为:磁性四氧化三铁微粒。在步骤C)中；在反应液中加入步骤a)中制得的标记待测物和待测目标物后，振荡吸附30分钟。在步骤c)中；反应液与标记待测物的体积比为50:1。在步骤d)中；在所述的电化学检测中，以玻碳电极为工作电极、钼片电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极。实施例一本实施例提供的检测方法包括以下步骤:1、酞菁钴标记小分子化合物的制备方法将带有氨基或羧基等活性基团的小分子化合物通过酰胺化反应(EDC/NHS反应)、重氮化法、戊二醛法等方法与氨基化酞菁钴偶联，实现酞菁钴对小分子抗原的标记。例如，以一种具有类过氧化氢酶催化活性的氨基化酞菁钴标记羧基化的三嗪类似物作为标记待测物分子:具体的，称取20mg修饰有羧基的待测物分子结构类似物溶于ImL含有200 μ L甲醇的ddH20，在其中分别加入IOOyL含IOmg EDC和NHS构成的偶联液，在37°C中活化30min，缓慢滴入含5mg氨基化酞菁钴的二甲基亚砜(DMSO)溶液，通过酰胺化反应(EDC/NHS反应)偶联2h。之后，与1%的脱脂乳粉在37°C下孵育lh，封闭掉未反应的羧基，洗涤一次，装入透析袋，用蒸馏水透析3d，每天更换2到3次透析液至透析完全，即获得偶联酞菁钴的待测物分子。2、磁性分子印迹聚合物的制备方案将8.1g FeCl3.6H20在142.5mL去离子水中溶解后，转移到三口烧瓶中，搅拌加热至70°C。称取4.4gFeCl2*4H20溶于IOmL去离子水，过滤，取7.5mL加入到三口烧瓶中。在剧烈搅拌下，快速加入24mL20%的NaOH溶液，于70°C下继续快速搅拌20min。反应结束后，得到黑色溶胶状物质，利用外加磁场将所得的沉淀从反应体系中分离出来，得到Fe3O4磁性纳米粒子。将5mL经超声分散后的Fe3O4悬浊液于三颈烧瓶中40°C水浴搅拌，在搅拌过程中，加入几滴油酸，然后依次加入50.0OmL无水乙醇、1.0OmL氨水、1.0OmL TE0S，反应3h。得到二氧化硅包覆的四氧化三铁(Fe3O4OSiO2)tj在250mL圆底烧瓶中加入Immol模板分子，4mmol (0.34mL)功能单体(MAA), 30mL溶剂及致孔剂(氯仿)，超声30min，置于4°C冰箱中避光，进行预组装过夜。第二天再向体系中加入2mL交联剂(Trim),以及0.2gFe304iSi02纳米粒子(作为磁性核心)，充分混勻后，通氮本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于酞菁钴标记电化学检测有机小分子的方法，其特征在于，包括以下步骤：a)、以一种具有类过氧化氢酶催化活性的酞菁钴标记待测物的类似物作为标记待测物分子；b)、通过聚合反应，将分子印迹聚合物包覆在磁性纳米粒子表面，并将其分散在反应液中；c)、在反应液中加入步骤a)中制得的标记待测物和待测目标物后，标记待测物与待测目标物竞争磁性分子印迹聚合物表面结合位点，形成竞争性特异结合反应；d)、通过磁铁分离，将磁性印迹聚合物及其吸附的目标物分离至试管底部，吸取上清，在其中加入含有对苯二酚和过氧化氢的溶液，通过差分脉冲伏安法，电化学检测体系中的氧化电流信号进而对待测物实现定量测量。

【技术特征摘要】
1.基于酞菁钴标记电化学检测有机小分子的方法，其特征在于，包括以下步骤: a)、以一种具有类过氧化氢酶催化活性的酞菁钴标记待测物的类似物作为标记待测物分子; b)、通过聚合反应，将分子印迹聚合物包覆在磁性纳米粒子表面，并将其分散在反应液中； c)、在反应液中加入步骤a)中制得的标记待测物和待测目标物后，标记待测物与待测目标物竞争磁性分子印迹聚合物表面结合位点，形成竞争性特异结合反应； d)、通过磁铁分离，将磁性印迹聚合物及其吸附的目标物分离至试管底部，吸取上清，在其中加入含有对苯二酚和过氧化氢的溶液，通过差分脉冲伏安法，电化学检测体系中的氧化电流信号进而对待测物实现定量测量。2.根据权利要求1所述的基于酞菁钴标...

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，王淼，佘永新，李腾飞，刘广洋，杜欣蔚，于海龙，金芬，邵华，金茂俊，王珊珊，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11