敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用技术

技术编号:10280538 阅读:212 留言:0更新日期:2014-08-03 00:14
本发明专利技术公开了一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用。本发明专利技术构建的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型可作为白色脂肪细胞褐色化的药物的筛选平台,可实现简单,迅速,大规模的筛选调控UCP1表达的药物;可以在不伤害非人哺乳动物的前提下,利用荧光成像仪直接活体检测UCP1的表达和分布。

【技术实现步骤摘要】
敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人晡乳动物模型及其构建方法和应用
本专利技术属于生物
,更具体地,本专利技术涉及一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用
技术介绍
长期以来,一直被认为脂肪细胞的主要功能是储存能量。但随着对脂肪细胞的深入研究,脂肪细胞其它方面的功能也逐渐显露出来。研究表明脂肪细胞在免疫反应、高血压、肥胖、胰岛素抵抗等代谢疾病中都起着重要的作用。最初,脂肪细胞被分为两类:白色脂肪细胞与褐色脂肪细胞。但随着啮齿动物腹股沟脂肪部位的beige (brown-1n-white, brite)细胞的发现,褐色脂肪细胞又可以被细分为两类:经典的褐色脂肪细胞与brite/beige脂肪细胞白色脂肪细胞内含有一个巨大的圆形脂滴,细胞核呈扁平状且位于细胞边缘。月旨滴几乎占据了细胞的99%的空间。白色脂肪细胞主要是通过甘油三酯和胆固醇的形式,将能量储存于脂滴当中。但是白色脂肪细胞不仅可以储存能量,它还可以分泌脂肪细胞因子如:脂联素、瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子α等等。这些脂肪细胞因子在能量代谢调节、免疫反应等多种生理现象中发挥着重要作用。褐色脂肪细胞的外形呈多边形,细胞核为圆形,且细胞内的脂滴呈多室分布于整个细胞中。褐色脂肪细胞 含有大量的细胞质基质,并且细胞内的线粒体含量很高。因为线粒体内的细胞色素含有铁原子,所以含有大量线粒体的褐色脂肪细胞的颜色为褐色。褐色脂肪细胞不同于白色脂肪细胞的主要特征是:线粒体内膜上的解偶联蛋白I(UCPI)的表达量很高。所以,褐色脂肪细胞的主要功能就是通过UCPl来产热从而消耗能量而不产生ATP:即褐色脂肪细胞可以通过UCP1,将线粒体内的电子传递链与ATP合成解偶联,进而通过氧化磷酸化解偶联呼吸,将脂肪酸β氧化产生的能量以热量的形式散失掉。褐色脂肪细胞的非颤栗性产热功能,可以维持体温恒定,也可以以热能的方式消耗机体摄入的能量,从而降低肥胖发生的概率。两种褐色脂肪细胞的分布是不同的,经典的褐色脂肪细胞主要分布于啮齿动物的肩胛骨区域,而Beige脂肪细胞主要分布于腹股沟区域的皮下脂肪组织中。对于人类来说,褐色脂肪细胞主要存在于婴儿体内,但是目前研究发现,成年人的颈部、锁骨上也含有相当量的褐色脂肪细胞,且它们与啮齿动物的beige脂肪细胞相似。除了分布差异外,两种褐色脂肪细胞的来源也不同。经典的褐色脂肪细胞与肌肉细胞同源;但是beige脂肪细胞存于白色脂肪组织中。研究发现,在一定条件下,冷冻,特定基因的敲除或者视黄酸(retinoidacid, RA),成纤维细胞生长因子21 (FGF21)等药物的刺激,beige脂肪细胞可以由白色脂肪细胞转分化而来。因此,beige脂肪细胞的研究受到了广泛关注。筛选可以使白色脂肪细胞褐色化(即转分化为beige脂肪细胞)的药物对于人类肥胖相关代谢疾病的治疗具有重大意义。筛选白色脂肪细胞褐色化的药物,主要需要检测UCPl的表达的变化,尤其是蛋白水平的变化。但是目前无论利用实时定量RT-PCR或者western blot的方法进行药物筛选,都费时费事费力费钱。实时定量PCR至少需要一天的时间来检测UCPl的变化,而westernblot至少需要两天的时间来进行检测分析。因此,构建一个可以快捷、准确地筛选白色脂肪细胞转分化成beige脂肪细胞的药物的平台显得尤为重要。
技术实现思路
基于此,为了克服上述现有技术的缺陷,本专利技术提供了一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用。为实现上述专利技术目的,本专利技术采取了以下技术方案:一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型在筛选白色脂肪细胞褐色化的药物中的应用。在其 中一个实施例中,所述非人哺乳动物为小鼠。本专利技术还提供了一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型的构建方法,包括以下步骤:I)、将非人哺乳动物的解偶联蛋白I基因的最后一个外显子后的终止密码子去掉;2)、利用序列号为SEQ ID NO:1的串联肽2A在步骤I)的去掉了终止密码子的解偶联蛋白I基因的最后一个外显子后连入荧光素酶基因;3)、利用C57和129杂合背景的小鼠ES细胞打靶,通过同源重组构建敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型。本专利技术还提供了采用上述构建方法构建得到的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型。本专利技术构建的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶非哺乳动物模型采用基因敲入的方式,将荧光素酶基因插入解偶联蛋白-1的特定位点,从而能准确反应基因的变化;而现有的具有荧光素酶的动物模型通常是采用转基因的方法将某个基因的启动子加上荧光素酶再随机插入到基因组中而构建得到的,插入的位点未必准确,从而使得并不能准确反应基因的变化。与现有技术相比,本专利技术具有以下有益效果:1、本专利技术构建的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型可作为白色脂肪细胞褐色化的药物的筛选平台,可实现简单,迅速,大规模的筛选调控UCPl表达的药物;相比较现有的其它方法,此模型只需要两个小时即可以完成一个24孔板的筛选。2、本专利技术构建的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型可以在不伤害非人哺乳动物的前提下,利用荧光成像仪直接活体检测UCPl的表达和分布,从而可准确的反应表达UCPl的组织部位。【附图说明】图1为本专利技术实施例1中敲入有UCPl-lcuiferase的小鼠模型的构建策略;图2是本专利技术实施例2中敲入有UCPl-lcuiferase的小鼠各个组织的荧光活性检测;图3是本专利技术实施例3中药物FGF21和Am580在小鼠的分离的皮下脂肪组织的脂肪干细胞分化的脂肪细胞的作用检测;图4是本专利技术实施例4中敲入有UCPl-lcuiferase的小鼠的活体成像图。【具体实施方式】以下结合附图和具体实施例来详细说明本专利技术。如无特殊说明,以下实施例中所使用的试剂均来源于市售,操作方法均为现有常规操作方法。实施例1敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的小鼠模型的构建方法如图1所示,为本实施例敲入有UCPl-lcuiferase的小鼠模型的构建策略图,包括以下步骤:1、去掉UCPl的终止密码子[0031 ] UCPl具有6个外显子,将UCPl的最后一个外显子即第6个外显子后的终止密码子去掉;2、连接荧光素酶基因利用串联肽2A(SEQ ID NO: 1,其目的是可以让荧光素酶基因随着UCPl共同翻译成蛋白,但是不与UCPl蛋白融合,因此不会影响UCPl蛋白的活性)在步骤I的去掉了终止密码子的UCPl的最后一个外显子的后边连入荧光素酶基因;连接荧光素酶基因后的序列如SEQ ID NO:2 所示;3、获得小鼠模型利用C57和129杂合背景的小鼠(采用常规方法分离得到)ES细胞打靶,通过同源重组构建敲入有UCPl-1uciferase的小鼠模型。实施例2实施例1的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的小鼠模型的各个组织荧光素酶信号检测包括以下步骤:I)取一只实施例1获得的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的小鼠,断颈处死,分离各个组织;2)每个组织分取20mg放入1.5mL离心管中,加入200uL荧光素酶信号检测缓冲液(150mM KCl,20mM HEPES,5mM Mgcl2, ImM EGTA。Na本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种敲入有解偶联蛋白1‑荧光素酶的非人哺乳动物模型的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:1)、将非人哺乳动物的解偶联蛋白1基因的最后一个外显子后的终止密码子去掉;2)、利用序列号为SEQ ID NO:1的串联肽2A在步骤1)的去掉了终止密码子的解偶联蛋白1基因的最后一个外显子后连入荧光素酶基因;3)、利用C57和129杂合背景的小鼠ES细胞打靶,通过同源重组构建敲入有解偶联蛋白1‑荧光素酶的非人哺乳动物模型。

【技术特征摘要】
1.一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型的构建方法,其特征在于,包括以下步骤: 1)、将非人哺乳动物的解偶联蛋白I基因的最后一个外显子后的终止密码子去掉; 2)、利用序列号为SEQID NO:1的串联肽2A在步骤I)的去掉了终止密码子的解偶联蛋白I基因的最后一个外显子后连入荧光素酶基因; 3)、利用C57和129杂合背景的小鼠ES细胞打靶,通过同源...

【专利技术属性】
技术研发人员:吴东海聂涛毛刘峰李快唐小凤惠晓艳刘彭涛徐爱民
申请(专利权)人:中国科学院广州生物医药与健康研究院
类型:发明
国别省市:广东;44

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