酵母抽提物的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种酵母抽提物的制备方法，选用N一糖酰胺酶F，依次进行以下步骤：1）将19～21g的酵母泥用50mM的pH7～8的磷酸钠缓冲液定容至100ml；使酵母泥悬浮于所述磷酸钠缓冲液中，得酵母液；2）在上述酵母液中加入0.5～1.0g的N一糖酰胺酶F，于36.5～37.5℃、120～180rpm酶解16～24小时；然后加入0.8～1.2g的氯化钠，再调pH至6.0后，于45～55℃恒温自溶18～28小时；接着灭酶活，于3500～4000rpm离心13～17分钟，收集上清液，于105℃干燥至恒重，得到酵母抽提物。

【技术实现步骤摘要】
酵母抽提物的制备方法
本专利技术涉及一种提高制备酵母抽提物得率的方法。
技术介绍
酵母抽提物是以酵母细胞（如啤酒酵母、酿酒酵母和产朊假丝酵母等）为原料，采用生物技术，将酵母细胞内的蛋白质、核酸经自溶、分离、真空浓缩、喷雾干燥等工艺精制而成的产物，含有丰富的蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、B族维生素、生长因子、微量元素等。酵母抽提物被作为一种非动物源性产品广泛应用于细菌和真菌的生长培养基，以及哺乳动物和昆虫细胞的无血清培养液中，另外在其它众多培养基配方中当作水溶性维生物、氨基酸、缩氨酸以及碳水化合物的营养源。这些培养基广泛应用在生化培养和生物制药领域，具有很高的产品附加值。在食品加工业，酵母抽提物是一种国际流行的营养性多功能天然鲜味剂和风味增强剂。在酵母抽提物的生产工艺中，酵母破壁是关键的一步，它直接决定产品的品质和得率。目前酵母破壁方法主要有：（1）自溶法，利用酵母菌体本身含有的各种酶（蛋白酶、核酸酶、糖水解酶等）的综合作用分解细胞壁，同时将酵母体内高分子物质水解成为可溶性小分子物质。由于酵母菌的细胞壁厚，自溶需要较长的时间，且得率低。（2）酶解法，在酵母自身含有的各种酶外，再另行加入外源蛋白酶，使得酵母释放内含物质并分解成小分子糖类、氨基酸、肽类等，酶解法得到的酵母抽提物品质较好，但是成本很高。（3）酸解法、以干酵母为原料，用盐酸或硫酸进行分解。酸解法的优势是提取物得率高、游离氨基酸量大，然而盐含量高、后处理成本高、污染程度大，现在基本不再采用。与多数细菌和动物细胞的结构不同，酵母菌细胞表面具有坚韧的厚细胞壁，其主要成分是葡聚糖和甘露聚糖。酵母菌的厚细胞壁是造成自溶破壁得率低的最重要因素。目前对如何选择外源破壁酶来分解细胞壁提高得率进行了大量的研究，有报道用(1-3),(1-6)葡聚糖酶(glucanase),甘露聚糖酶(mannase),和kitanase无法有效地破壁提高酵母抽提物的得率，而用来自植物的巯基蛋白酶，特别是木瓜蛋白酶，能有效地破壁提高得率（Boonraeng,S.,P.Foo-trakul,W.KanlayakritandC.Chetanachitra,2000.Effectsofchemical,biohemicalandphysicaltreatmentsonthekineticsandontheroleofsomeendogenousenzymesactionofbaker’syeastlysisforfood-gradeYEproduction.KasetsartJ.Nat.Sci.,34:270-278Conway,J.,H.GaurdeauandC.P.Champagne,2001.TheeffectoftheadditionofproteasesandglucanasesduringyeastautolysisontheproductionandpropertiesofYes.CanJ.Microbiol.,47:18-24.）。来自植物的巯基蛋白酶，例如木瓜蛋白酶，目前无法用重组基因工程技术表达生产，只能从木瓜中提取获得，价格很高，占用大量农田种植，浪费自然资源。当使用木瓜蛋白酶时，其相应的工艺步骤和工艺参数如下：将酵母泥悬浮于50mMpH5.5的柠檬酸钠缓冲液，配成20%的酵母液，加入1.0%的木瓜蛋白酶，在45℃,150rpm酶解20小时，然后90℃加热灭酶活20分钟，3800rpm离心15分钟，收集上清液，于105℃干燥至恒重，得到酵母抽提物。产品得率（%）为：86.3%；总氮（%）为：10.6%；氨基氮（%）：4.7%。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种工艺简洁、成本低廉的酵母抽提物的制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种酵母抽提物的制备方法，选用N一糖酰胺酶F，依次进行以下步骤：1）、将19～21g（较佳为20g）的酵母泥用50mM的pH7-8的磷酸钠缓冲液定容至100ml；使酵母泥悬浮于所述磷酸钠缓冲液中，得酵母液（即，为19～21%的酵母液）；2）、在上述酵母液中加入0.5～1.0g（较佳为0.5g）的N一糖酰胺酶F，于36.5～37.5℃、120～180rpm酶解16～24小时小时（较佳为37℃、150rpm酶解20小时）；然后加入0.8～1.2g（较佳为1g）的氯化钠，再调pH至6.0后，于45～55℃恒温自溶18～28小时；接着灭酶活，于3500～4000rpm离心13～17分钟（较佳为3800rpm离心15分钟），收集上清液，于105℃干燥至恒重，得到酵母抽提物。作为本专利技术的酵母抽提物的制备方法的改进：所述步骤1）中：磷酸钠缓冲液的pH为7.5；所述步骤2）中：于50℃恒温自溶20小时。作为本专利技术的酵母抽提物的制备方法的进一步改进：所述步骤2）的灭酶活为：恒温自溶后于90℃灭酶活20分钟。备注说明：N一糖酰胺酶F可根据已报道的方法（SuYS,WangSJ,WangP,QiQS.2005,HighlevelexpressionofPNGaseFinEscherichiacolianditsbioactivities,ShengWuGongChengXueBao.21,911-5），应用重组基因工程技术在大肠杆菌表达体系中表达纯化获得。当然，N一糖酰胺酶F也可以通过市购的方式获得。酵母细胞壁的甘露聚糖主要来自糖蛋白上N-糖肽键连接的糖链(N-糖链)，糖链的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）与蛋白质中天冬酰胺（Asn）的酰胺基通过共价键连接形成N-糖肽键。酵母细胞壁的N-糖链多数有这样一个核心结构：Man10–14GlcNAc2-Asn。核心结构的外链上有额外约50-200个甘露糖（Man），其长的主链由甘露糖间以α-(1→6)键形成，主链上有以α-(1→2)和α-(1→3)键连接数目不等的甘露糖侧链。酵母细胞壁的N-糖链我们简单地表示为这样的结构：Man60–200GlcNAc2-Asn。N一糖酰胺酶F(PNGaseF)是由脑膜炎脓杆菌等革兰氏阴性菌分泌的一种酰胺水解酶，N一糖酰胺酶F能从糖蛋白完整切下N一糖链，并将蛋白质的天冬酰胺残基转化为天冬氨酸，如下式1所示：式1、N一糖酰胺酶F能从糖蛋白完整切下N一糖链，切割位点用箭头示出。N一糖酰胺酶F(PNGaseF)是目前已知唯一一个由革兰氏阴性菌分泌的一种酰胺水解酶，它有314个氨基酸，分子量为35kDa，能作用于蛋白质上各种不同的糖链。与N一糖酰胺酶F有相似作用的酰胺水解酶在其它种属如真菌，动物或植物中也存在，但它们多数存在于细胞内，未分泌到细胞外，主要作用于细胞内的糖蛋白，作用的糖链结构也各不相同，有一定的特异性。这些酰胺水解酶与N一糖酰胺酶F在基因和蛋白序列上没有同源性，结构也不相同。例如酿酒酵母细胞质内的N一糖酰胺酶（yPng1p）有363个氨基酸，分子量为43kDa，在细胞内糖蛋白的降解过程中起作用。而来自杏仁的N一糖酰胺酶A（PNGaseA）由分子量为21kDa和54kDa的两个亚基构成，主要作用于小分子的糖多肽。备注说明：N一糖酰胺酶yPng1p和N一糖酰胺酶A可根据已报道的方法分别从酿酒酵母和杏仁中纯化得到（SuzukiT1,ParkH,KitajimaK,L本文档来自技高网...

【技术保护点】
酵母抽提物的制备方法，其特征是：选用N一糖酰胺酶F，依次进行以下步骤：1）、将19～21g的酵母泥用50mM的pH7～8的磷酸钠缓冲液定容至100ml；使酵母泥悬浮于所述磷酸钠缓冲液中，得酵母液；2）、在上述酵母液中加入0.5～1.0g的N一糖酰胺酶F，于36.5～37.5℃、120～180rpm酶解16～24小时；然后加入0.8～1.2g的氯化钠，再调pH至6.0后，于45～55℃恒温自溶18～28小时；接着灭酶活，于3500～4000rpm离心13～17分钟，收集上清液，于105℃干燥至恒重，得到酵母抽提物。

【技术特征摘要】
1.酵母抽提物的制备方法，其特征是：选用N-糖酰胺酶F，依次进行以下步骤：1)、将19～21g的酵母泥用50mM的pH7～8的磷酸钠缓冲液定容至100ml；使酵母泥悬浮于所述磷酸钠缓冲液中，得酵母液；酵母为酿酒酵母；2)、在上述酵母液中加入0.5～1.0g的N-糖酰胺酶F，于36.5～37.5℃、120～180rpm酶解16～24小时；然后加入0.8～1.2g的氯化钠，再调pH至6.0后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜有为，
申请(专利权)人：杭州菁因康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33