本发明专利技术公开了一种测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒，属于含量测定的化学方法技术领域。本方法以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品或标准品中的SSa竞争结合一定量的抗SSa的单抗；用稀土离子Eu3+标记SSa-HSA复合物作为示踪物。发光增强系统采用以β-二酮体为主的增强液。采用间接竞争法测定柴胡药材等样品中SSa的含量。方法学考察：该方法的灵敏度(检测限)为0.006ug/ml；检测范围为0.01～5ug/ml；批内CV平均值为7.3％；批间CV为9.08％；平均回收率为115.07％；标准曲线相关系数为0.9981。本发明专利技术建立的SSa的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒灵敏度高，检测范围宽，稳定性好，无毒性，尤其应用于大样本的检测时快速、高效，有良好开发使用价值。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒，属于含量测定的化学方法
。本方法以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品或标准品中的SSa竞争结合一定量的抗SSa的单抗；用稀土离子Eu3+标记SSa-HSA复合物作为示踪物。发光增强系统采用以β-二酮体为主的增强液。采用间接竞争法测定柴胡药材等样品中SSa的含量。方法学考察：该方法的灵敏度(检测限)为0.006ug/ml；检测范围为0.01～5ug/ml；批内CV平均值为7.3％；批间CV为9.08％；平均回收率为115.07％；标准曲线相关系数为0.9981。本专利技术建立的SSa的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒灵敏度高，检测范围宽，稳定性好，无毒性，尤其应用于大样本的检测时快速、高效，有良好开发使用价值。【专利说明】测定柴胡皂苷a含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒
本专利技术属于含量测定的化学方法
，具体涉及一种测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒。
技术介绍
柴胡为常用中药，其来源为伞形科植物柴胡(习称“北柴胡”)BUpleUrUm chinenseDC.或狭叶柴胡(习称“南柴胡”)B.scorzonerifolium ffilld.的干燥根。其主要成分为柴胡皂苷、挥发油。柴胡皂苷为三萜皂苷类中药成分，许多研究表明柴胡皂苷具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、调节内分泌及免疫系统等作用。其中柴胡皂苷a、d含量最高，在2010年版《中国药典》中已经纳入柴胡质量标准含量测定项。柴胡皂苷的测定方法有很多，传统方法中大致有利用物理性质如泡沫指数法和皂苷指数法；化学测定法包括比色法、薄层色谱扫描法以及生物测定法-溶血指数法。此外还有分离比色法。现在许多新的技术也相继普遍应用于含量测定，如=HPLC法、高效毛细管电泳法等。且已不局限于某一种技术的单独使用，而是两种或多种技术的配合使用。近些年，也有利用单克隆抗体技术制备出抗柴胡皂苷a单克隆抗体，建立测定ssa的含量酶联免疫吸附法。相比较于酶联免疫吸附法的酶标记物不稳定性，荧光衰变周期短。TRFIA法用稀土元素离子Eu3+作为示踪物，以其荧光寿命长，激发谱带宽而发射光谱很窄等特点排除非特异性荧光的干扰，具有较高的灵敏度和准确性。我国有丰富的稀土元素资源，本方法稳定性好的同时又合理利用了稀土元素资源。
技术实现思路
本专利技术克服现有技术的样品预处理繁、进行大样本测量分析时耗时长、需要使用大量有毒、昂贵的有机试剂、操作复杂、检测范围窄等上述缺陷，提出了一种测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法，采用时间分辨荧光免疫分析技术，建立柴胡皂苷a的定量分析方法。本专利技术方法具有操作简便、时间短、灵敏度高、稳定性好等优点，尤其有利于大样本或低浓度样品的检测。本专利技术提出了一种测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法，以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板,与样品中的柴胡阜苷a(SSa)竞争结合一定量的抗柴胡阜苷a的单抗；用稀土离子Eu3+标记SSa-HSA复合物作为示踪物；发光增强系统采用以β _ 二酮体为主的增强液；采用间接竞争时间分辨荧光免疫分析法，从而测定样品中的柴胡皂苷a含量。其中，所述样品包括待测样品或标准品。本专利技术测定柴胡皂苷a(SSa)含量的时间分辨荧光免疫分析法，包括如下步骤:(I)以4ug/ml兔抗鼠IgGlOOul/孔包被96孔酶标板，4°C反应过夜；(2)常温振荡lh，洗涤液清洗3次后，280ul/孔封闭液常温封闭lh，清洗4次，拍干；(3)取柴胡皂苷a标准对照品(中国药品生物制品检定所)，配制成溶剂为10%甲醇水的标准品，每孔加入25ul标准品，浓度分别为Ong/ml、10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml,2000ng/ml、5000ng/ml、，每个浓度3孔。再加入以稀释缓冲液1: 4000倍稀释的抗柴胡皂苷a皂苷单克隆抗体溶液和1: 800倍稀释的标记抗原复合物，贴封膜，于常温下振荡反应Ih ；(4)反应结束后，清洗6次，拍干，加入增强液(由南方医科大学抗体技术研究中心提供；成分:冰醋酸、邻苯二甲酸氢钾、Triton Χ-100、Τ0Ρ0、β-ΝΤΑ、纯化水)200ul，振荡5min后，用荧光免疫分析仪Victor 1420测定其荧光信号。(5)根据荧光值，建立标准曲线。以柴胡皂苷a的标准品建立TRFIA的标准曲线。以上步骤(3)中以同样方法配制待测样品，经检测，在步骤(5)中测得待测样品中的柴胡皂苷a含量。SSa-HSA复合物的制备:在lmll0mg/mlNa104溶液中，加入0.5ml溶解SSa5.0mg的甲醇溶液，室温避光搅拌反应lh。将反应混合物加至lml5mg/ml的HSA溶液(50mmol/L碳酸盐缓冲液，PH9.6)中，用lmol/L的Na2C03溶液调节至pH9左右，搅拌12h，对水透析5次。铕标记抗原结合物的制备:将合成的SSa-HSA复合物用标记缓冲液来纯化、浓缩，再比例加入Eu-DTTA(抗原:Eu-DTTA = 2: I)，充分混匀后放入室温孵育16-20小时后，缓慢加入纯化柱内，然后换成洗脱缓冲液对样品进行洗脱，待蛋白检测仪显示出现蛋白峰时，开始收集样品，1.5ml/管，加BSA溶液至含量0.1 %。分装，部分于_20°C保存，部分于4°C备用。其中，所述增强液(成分:冰醋酸、邻苯二甲酸氢钾、Triton Χ_100、Τ0Ρ0、β _ΝΤΑ、纯化水)。较佳地，增强液是以β_ 二酮体为主的增强液。其中，所述方法以稀土离子Eu3+标记SSa-HSA复合物作为示踪物，并用增强-解离系统扩大荧光信号。其中，所述方法的检测灵敏度为0.006ug/ml。其中，所述方法的含量检测范围为10_5000ng/ml。其中，所述方法的批内CV平均值为7.3% ;批间CV为9.08% ;平均回收率为115.07% ;标准曲线线性回归相关系数为0.9981。本专利技术还提供了 一种试剂盒，利用本专利技术中建立的时间分辨荧光免疫分析方法，进行相关样品中柴胡皂苷a含量测定。试剂盒包括:酶标包被板，标准品，抗柴胡皂苷a单克隆抗体，铕标记复合物，洗涤液，稀释液，增强液。本专利技术试剂盒中，所述标准品的浓度分别为 Ong/ml、10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml, 2000ng/ml>5000ng/ml,加样量 25ul/ 孔；测定前，以稀释液将抗柴胡皂苷a单克隆抗体4000倍和铕标记复合物800倍稀释，按先后顺序加入IOOul/孔；增强液的加液量为200ul/孔。本专利技术区别于现有技术的改进包括:用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，并用增强-解离系统扩大荧光信号，利用单克隆抗体技术制造出抗柴胡皂苷a单克隆抗体，使用免疫荧光分析方法应用于中药成分的含量测定。本专利技术中采用现有技术来制备抗柴胡皂苷a单克隆抗体以及制备柴胡皂苷a与人血清白蛋白复合物。区别于现有技术，本专利技术分析法包括了解离增强步骤和荧光检测环节。本专利技术分析法中包括的解离增强步骤:现有技术中的解离增强镧系元素荧光免疫分析(DELFIA)是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕(Eu)连接，另本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定柴胡皂苷a含量的时间分辨荧光免疫分析法，其特征在于，以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品中的柴胡皂苷a竞争结合抗柴胡皂苷a的单抗，用稀土离子Eu3+标记SSa‑HSA复合物作为示踪物，以增强液作为发光增强系统，利用间接竞争时间分辨荧光免疫分析法，测定所述样品中的柴胡皂苷a含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：晁志，崔倩，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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