一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的制备工艺制造技术

技术编号:10067609 阅读:201 留言:0更新日期:2014-05-23 05:48
本发明专利技术公开了一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的方法,操作如下:将重组人干扰素α2b表达菌体裂解后的菌体裂解液依次用pH不低于7.0的第一透析液和pH低于4的第二透析液进行透析,透析后分离纯化得到天然构象含率高的重组人干扰素α2b。通过采用两步透析法对干扰素α2b进行复性,其中,第二步采用低pH透析的方案,其最初目的在于将进一步降低盐酸胍浓度并更换缓冲体系,同时与去除酸不稳定的杂蛋白。但是通过实验意外发现,这种两步复性法在未降低复性率的同时,可以极大地提高天然构象干扰素的得率,促使SMM及聚集体或中间态向天然构象转化,降低SMM及聚集体含量。

【技术实现步骤摘要】
一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的制备工艺
本专利技术涉及蛋白质药物生产领域,具体涉及一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的方法。
技术介绍
干扰素(Interferon,IFN)由英国科学家Isaacs和LinderMann于1957年发现,是一类具有广谱抗病毒活性的蛋白质。根据其氨基酸结构、抗原性和细胞来源,可将其分为三类:α干扰素、β干扰素以及γ干扰素。其中α干扰素是应用较为广泛的一类干扰素,临床上主要用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性疾病;也用于一些肿瘤化疗药物的联合用药。α干扰素至少有20种以上的不同亚型,其家族成员具有相似的结构特点:氨基酸数目为165或166,氨基酸成分相似,不同亚型间氨基酸序列同源性为70%,第1、29、98/99和138/139位上的半胱氨酸非常保守,形成两个二硫键(C1-C98、C29-C138,或C1-C99、C29-C139),二硫键对干扰素α的正确折叠、维持干扰素的立体结构和生物学活性十分重要。干扰素中两对二硫键的形成是正确折叠的关键。两对二硫键的形成需要不同的氧化还原条件,其中C29-C139容易形成,而Cl-C99则需要更强的氧化条件。因此,常规方法复性的α干扰素在氧化型电泳中存在快迁移单体(FMM)和慢迁移单体(SMM),一般认为:SMM是由于其一对二硫键(Cl—C99)没有配对所造成的。SMM可以视作复性过程的一种中间体,在一定条件下可以向Nature(天然构象,N)构象转化,这种转化需要较高的氧化条件;同时也容易形成链间二硫键而聚集形成寡聚物(Oligomer)。N构象是指与人体自身分泌干扰素具有同样构象的一种存在,同SMM及Oligomer比较,其具有比活高、免疫原性低;人体依从性好等特征。采用高浓度盐酸胍溶解,随后逐步降低盐酸胍浓度是蛋白质复性的最常用方法之一,降低盐酸胍浓度可以采用稀释或透析两种方法。而稀释液或透析液往往都采用偏碱性的缓冲体系。较为常规/简单的复性液(稀释液或透析液)基础组分为pH为8左右的磷酸缓冲液或Tris-盐酸缓冲液。为了有效地促进SMM向N构象转化,人们会在上述基础复性液中加入氧化还原对,以期提高复性效率,常用的氧化还原对有还原型和氧化型的谷胱甘肽(GSH/GSSG),其使用浓度为l~3mMGSH,GSH与GSSG比例为1~10:1。但是,由于较高的氧化环境及碱性条件,甲硫氨酸的硫醚基团可能被氧化成亚砜或砜,如文献(刘云东,“复合干扰素包涵体折叠复性、分离纯化及稳定性研究”)认为甲硫氨酸氧化会在“反相上出现保留时间时间较天然结构小的杂峰”,如图4所示,在含有GSH/GSSG的复性液的实施例中,该杂峰含量明显增加。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的方法,其可有效提高重组人干扰素α2b中天然构象含率。为实现上述目的,本专利技术采用以下方案进行实施:一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的方法,操作如下:将重组人干扰素α2b表达菌体裂解后的菌体裂解液依次用pH不低于7.0的第一透析液和pH低于4的第二透析液进行透析,透析后分离纯化得到天然构象含率高的重组人干扰素α2b。通过采用两步透析法对干扰素α2b进行复性,其中,第二步采用低pH透析的方案,其最初目的在于将进一步降低盐酸胍浓度并更换缓冲体系,同时与去除酸不稳定的杂蛋白。但是通过实验意外发现,这种两步复性法在未降低复性率(即复性液中α干扰素的总含量)的同时,可以极大地提高天然构象干扰素的得率,促使SMM及聚集体或中间态向天然构象转化,降低SMM及聚集体含量。进一步的方案为:第一透析液的pH为7.0~8.0,第二透析液的pH为2.0~3.6。第一透析液为Tris-盐酸、巴比妥钠-盐酸、硼酸-硼砂、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠中一种或几种配制的碱性缓冲液。第一透析液为饮用水或纯净水。第二透析液为醋酸-醋酸钠、甘氨酸-盐酸、邻苯二甲酸-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠中一种或几种配制的酸性缓冲液,另外第二透析液也可为醋酸的水溶液、盐酸的水溶液。用第一、二透析液透析时所用透析袋的透过分子量为8000D。上述只是列举了几种可以作为第一、二透析液的溶液体系,当然本领域技术人员可以根据上述列举的溶液体系以及其所起的作用,结合本领域技术人员常规手段和公知常识而进行相应的改变,用其他溶液体系进行替换,也即是说,本专利技术中的第一、二透析液不限于上述限定的溶液体系。在实现本专利技术目的的基础上,通过后续的大量实验和研究发现,温度对复性结果也有一定的影响,特别是在第二透析液中进行透析时。对温度的研究结果表明,当用第二透析液透析的温度为4~15℃的条件下,天然构象含量无明显改善;在28~33℃的条件下,天然构象可以达到80%;当温度升至37℃时,虽然SDS-PAGE与RP-HPLC结果无明显变化,但蛋白总回收率降低至原来的一半。因此,本专利技术中进一步的方案为:第一透析液透析的温度为4~10℃、时间为12~24h条件下完成的。第二透析液透析的温度为20~37℃、时间为12~24h完成。更为具体的方案为,菌体与盐酸胍按照1:2~5(w/v)的质量体积比混合进行裂解。重组人干扰素α2b表达菌体为表达重组人干扰素α2b大肠杆菌。分离纯化包括第二透析液透析后对重组人干扰素α2b菌体裂解液进行离心,过滤回收上清液,然后将上清液经单抗亲和层析吸附及洗脱,收集得到天然构象含率高的重组人干扰素α2b。通过上述的实施,可将正确复性率(Nature构象的比重)从40%提升至80%。其中RP-HPLC主峰含量从15%提升至60%,大大提高天然构象含量,减小了纯化压力。另外,在复性过程中,采用菌体裂解液直接透析的方法,省去了包涵体洗涤及离心收集沉淀及溶解这一步骤,大大缩短了重组人干扰素α2b纯化提取的工艺流程。附图说明图1为干扰素α2b对照品的RP-HPLC图谱;图2为实施例1所获产品的RP-HPLC图谱;图3为实施例2所获产品的RP-HPLC图谱;图4为实施例3所获产品的RP-HPLC图谱;图5为实施例1~3中所获干扰素α2b的氧化和还原型电泳图谱。具体实施方式以下结合具体实施方式来对本专利技术作进一步的说明。目前,大多采用的是蛋白回收率及活性回收率来考察复性效率,这种研究存在的局限在于:由于相关蛋白与天然构象差异较小,其比活性差异更微乎其微,且比活测定采用细胞抑制法也存在较大误差,因此采用上述考察方法,所得到的复性率的概念大多指的是复性液中可溶性干扰素的含量,所指是复性收率这一概念。无法真实准确反映天然构象含量的实际情况;而由于复性液中杂质/杂蛋白的干扰,亦无法直接通过RP-HPLC或SDS-PAGE来考察。为了充分验证复性结果的可靠性和准确性,本专利技术中采用单抗亲合层析这一技术对复性结果予以评价:单抗层析介质采用抗原抗体结合原理,专一性捕获干扰素及其相关蛋白(包括各种异构体及聚集体)而不与杂蛋白结合,将复性液直接与单抗衔接,通过洗脱峰蛋白含量测定来考察回收率:以避免其他降解途径的干扰;对洗脱峰进行SDS-PAGE与RP-HPLC检测,来考察天然构象的含量。SDS-PAGE可以较为有效的鉴别α干扰素SMM、FMM以及寡聚物(Oligomer),寡聚物由于分子量大,位于凝胶上方;SM本文档来自技高网
...
一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的制备工艺

【技术保护点】
一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的方法,操作如下:将重组人干扰素α2b表达菌体裂解后的菌体裂解液依次用pH不低于7.0的第一透析液和pH低于4的第二透析液进行透析,透析后分离纯化得到天然构象含率高的重组人干扰素α2b。

【技术特征摘要】
1.一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的方法,操作如下:将重组人干扰素α2b表达菌体裂解后的菌体裂解液依次用pH为7.0~8.0的第一透析液和pH为2.0~3.6的第二透析液进行透析,透析后分离纯化得到天然构象含率高的重组人干扰素α2b;第一透析液透析的温度为4~10℃、时间为12~24h;第二透析液透析的温度为20~37℃、时间为12~24h。2.如权利要求1所述的提高重组人干扰素α2b天然构象含率的方法,其特征在于:第一透析液为Tris-盐酸、巴比妥钠-盐酸、硼酸-硼砂、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠中一种或几种配制的碱性缓冲液,或者第一透析液为饮用水或纯净水。3.如权利要求1所述的提高重组人干扰素α2b天然构象含率的方法,其特征在于:第二透析液为醋酸-醋酸钠、甘氨酸-盐酸、邻苯二甲酸-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸...

【专利技术属性】
技术研发人员:宋礼华王荣海许培董世建周乐春李增礼沈毅
申请(专利权)人:安徽安科生物工程集团股份有限公司
类型:发明
国别省市:

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1