一种超敏的免疫电镜标记方法技术

本发明专利技术公开了一种超敏的免疫电镜标记方法，包括以下步骤：把生物样品待测抗原用体积百分比为0.1-2.5%的戊二醛溶液和质量百分比为1.5-5%多聚甲醛溶液固定后，经过脱水程序后，经过亲水性树脂包埋，切成超薄切片后，分别用特定的第一抗体标记生物样品待测抗原，再以吸附超微金颗粒的第二抗体标记第一抗体，然后利用银加强放大试剂在超微金颗粒周围形成直径较大的银颗粒，然后在电镜下即可敏感地检测待测抗原在生物样品中的表位。本发明专利技术具有灵敏高的优势，兼有阳性信号颗粒相对均匀，便于研判的优势，也同时具有可以检测生物样品内部抗原的优势。本发明专利技术适合检测位于生物医学标本内部的微量抗原的检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，包括以下步骤：把生物样品待测抗原用体积百分比为0.1-2.5%的戊二醛溶液和质量百分比为1.5-5%多聚甲醛溶液固定后，经过脱水程序后，经过亲水性树脂包埋，切成超薄切片后，分别用特定的第一抗体标记生物样品待测抗原，再以吸附超微金颗粒的第二抗体标记第一抗体，然后利用银加强放大试剂在超微金颗粒周围形成直径较大的银颗粒，然后在电镜下即可敏感地检测待测抗原在生物样品中的表位。本专利技术具有灵敏高的优势，兼有阳性信号颗粒相对均匀，便于研判的优势，也同时具有可以检测生物样品内部抗原的优势。本专利技术适合检测位于生物医学标本内部的微量抗原的检测。【专利说明】
本专利技术属于现代生物医学
，特别涉及。
技术介绍
免疫电镜是利用免疫组织化学技术和电镜技术在超微结构水平上观察待测抗原在生物医学样品中的精确定位的方法。早年的免疫电镜技术使用的是酶标法，现在的免疫电镜技术往往使用的是金标二抗的方法。二抗也称为第二抗体，是一种蛋白质，可以与直径不同的金颗粒通过静电作用形成金标二抗，如果这种金标二抗与一抗结合，一抗再与其相应的抗原发生特异性偶联作用，在电镜下就会形成代表相应抗原表位的致密颗粒。目前使用金标二抗的免疫电镜技术分为包埋前免疫电镜和包埋后免疫电镜两大类。包埋前免疫电镜，顾名思义就是在经过电镜技术的包埋程序之前就对待测生物样品进行免疫标记。一般而言，普通抗体的直径是10nm，在与金颗粒发生静电结合时，金颗粒的直径越小，附着在抗体周围的金颗粒也就越多，在标记、洗脱过程中也越不容易使金颗粒丢失，在电镜下显示的代表待测抗原表位的颗粒也就越多。也就是说，和二抗发生静电结合的金颗粒直径越小，在检测待测抗原时敏感性越高。但是如果直径太小，如金颗粒直径在0.8nm-l.4nm时，即使在电镜的高倍模式下也不容易观察到金颗粒，因此，包埋前免疫电镜技术往往需要利用银加强试剂，使以金颗粒为核心的位置再富集上直径5-50nm的银颗粒，从而间接显示出生物样品待测抗原的表位。包埋前免疫电镜的优点:检测的敏感性高。因为包埋前免疫电镜使用的是直径是0.8nm-l.4nm的超微金颗粒,直径10_15nm的二抗很容易吸附如此细小的超微金颗粒,并且可以抵抗严格的漂洗条件。经过银加强步骤后，可以很敏感地显示待测抗原的精确表位，而且可以根据需要通过延长银加强试剂的孵育时间来控制超微金颗粒周围的富集的银颗粒直径，使其达到放大5-50倍的效果而不影响标记的敏感性。包埋前免疫电镜的缺点。首先，只能标记样品浅层的样品(如实施例1)。吸附有直径是0.8nm-l.4nm的金标二抗，即使在加入穿透剂的情况下，其穿透能力非常有限，一般都会低于10 μ m，不能标记生物样品深层的抗原，对于大块的生物样品如脑片可以通过振动切片完成，如果是很小的生物样品如果蝇的胚胎、脑等器官，就很难达到标记效果。其次，为了增加待测样品的深度，包埋前免疫电镜操作程序中往往会使用一定浓度的非离子型去污剂Tween-20或者表面活性剂Triton X-100,这两类化学物质往往会造成生物样品超微结构损坏或者丢失，从而可能影响待测抗原的检测。再次，包埋前免疫电镜在使用银加强放大步骤时，由于生物样品的细胞内部结构和组分分布高度不均匀，银颗粒在金颗粒周围富集形成致密核心时，其穿透待测生物样品所进入的距离和路径不一致，将导致最后形成的银颗粒核心直径大小不一(如实施例1)，如果这些直径相差较大，将会干扰对检测结构的判断，而且不能做定量分析。包埋后免疫电镜，顾名思义就是在经过电镜技术的包埋程序之后才对待测生物样品进行免疫标记。包埋后免疫电镜的优点。首先，可以检测生物样品内部的待测抗原。其次，包埋后免疫电镜不使用穿透剂，可以使待测生物样品的超微结构和待测抗原得到较好的保存；再次，根据金颗粒的数量，可以对待测样品作半定量分析。包埋后免疫电镜的缺点。由于包埋后免疫电镜使用的金标二抗的金颗粒直径达到5-50nm,而与金颗粒结合的二抗直径大约为10_15nm，与之结合的金颗粒数量比包埋前免疫电镜使用的0.8-1.4nm的超微金颗粒数量低得多，而且在标记、洗脱过程中金颗粒容易丢失，因此包埋后免疫电镜标记的敏感性低(如实施例2)，而且金颗粒越大，敏感性越低。另一方面，生物样品的超薄切片一般厚度为IOOnm左右，如果利用直径较大的金标二抗，其穿透样品的能力也会受到影响。因此，以包埋后免疫电镜技术检测生物样品的待测抗原，敏感性将降低。
技术实现思路
专利技术目的:针对上述现有技术存在的问题和不足，本专利技术充分结合了包埋前免疫电镜和包埋后免疫电镜的优点，提供了 一种超敏感的免疫电镜标记方法。技术方案:为了解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案如下:，包括以下步骤:把生物样品待测抗原体积百分比为0.1-2.5%的戊二醛溶液和质量百分比为1.5-5%多聚甲醛溶液固定后，经过脱水程序后，经过亲水性树脂包埋，切成超薄切片后，分别用特定的第一抗体标记生物样品待测抗原，再以吸附超微金颗粒的第二抗体标记第一抗体，然后利用银加强放大试剂在超微金颗粒周围形成直径较大的银颗粒，然后在电镜下即可敏感地检测待测抗原在生物样品中的表位。其中，上述亲水性树脂为K4M或L.R.White。其中，上述超薄切片厚度为60_100nm。其中，超微金颗粒直径为0.8nm-l.4nm。本专利技术的具体步骤如下:利用包埋后免疫电镜程序，将待测生物样品经过溶解在0.1M的磷酸盐缓冲液或二甲胂酸钠缓冲液的1.5-5%多聚甲醛溶液和0.1-2.5%戊二醛双固定(PH7.0-7.6)、经过0.1M的磷酸盐漂洗和脱水后，包埋在亲水性树脂K4M或L.R.White中，并使样品在树脂中聚合成坚硬的块状；把包埋于亲水性树脂K4M或L.R.White中待测生物样品在超薄切片机中切成60-100nm的超薄切片，并收集于金网或者镍网中；将载有待测生物样品的金网或者镍网以去离子水孵育5分钟后，再以含有BSA的封闭液中封闭30分钟，然后以第一抗体孵育30分钟，再以含有BSA的封闭液洗涤三次，以洗去没有特异性结合的第一抗体；将0.8nm或者1.4nm的超微金标记的第二抗体标记第一抗体30分钟,再以含有BSA的封闭液洗涤三次，以洗去没有特异性结合的第二抗体；以银加强试剂使镍网中的第二抗体的超微金颗粒放大，放大的时间根据需要控制在10-30分钟，时间越长，在超微金颗粒表面形成的银颗粒结晶越大，越容易观察。将经银加强放大的载有待测生物样品的镍网经过0.1MPBS (PH=7.4)洗涤三次，1%的戊二醛后固定，再经常规的柠檬酸铅和醋酸双氧铀染色后，在透射电镜下观察、拍照。有益效果:与现有技术相比，本专利技术克服了包埋前免疫电镜技术穿透生物样品能力弱的弊端，保留了其灵敏高的优势，克服了包埋后免疫电镜技术灵敏低，但是无需抗体穿透生物样品内部(包埋后免疫电镜技术使用的超薄切片是60-100nm)的优点。本专利技术适合检测位于生物医学标本内部的微量抗原的检测，而且所出现的阳性信号相对均匀，便于判断。利用本专利技术的方法，以突触囊泡标记分子突触素(Synapsin)标记突触囊泡为例，利用直径为1.4纳米的金标二抗标记突触素，再以银加强试剂放大，对比直接以直径为15纳米的金标二抗标记突触素，其灵敏度可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：甘光明，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：